：请问 ICC 和 IF 有何区别？是同一个实验吗？
：哎嘿，这题我会!

：免疫细胞化学 (Immunocytochemistry, ICC) 在细胞样本上对靶抗原进行检测和定位。免疫荧光 (Immunofluorescence, IF) 则是主要使用荧光标记物对抗体进行标记，从而实现对抗原的可视化检测。荧光标记既可以用于免疫细胞化学法 (细胞) 也可以用于免疫组织化学法 (组织)。

：哇哦~晓得了，有没有操作流程嘞？
：流程？在下面喽~

Section.01
第一步: 样品准备

细胞免疫荧光技术是一种基于抗体与标记物相互作用的技术。它通过特异性的抗体与细胞表面或细胞内分子结合，再通过标记物在荧光显微镜下进行观察。实验流程通常包括样品制备、固定、通透、封闭、抗体孵育、复染、封片和观察 8 个部分。

 
步骤

1. 固定：使用 4% 的多聚甲醛固定细胞 10 ~ 15 min；
2. 洗涤：使用 PBS 缓冲液清洗 3 次，以去除残留的固定液。

Tips:

1. 初次实验，建议从 4% 的多聚甲醛,固定 15 min 开始尝试，倘若没有达到预期效果，再调整固定时间或更换另一种固定剂。
2. 较长的孵育时间通常会导致更高的固定程度，直至表位可能过度固定。孵育时间短可能导致表位保存不良和样品固定不足。最佳固定时间需要根据经验确定。

Section.03
第三步: 通透

目的

通过去污剂部分溶解细胞膜，形成孔洞，从而使抗体能够到达细胞内表位，与细胞内的抗原结合。(该步骤可选做；通透步骤会破坏细胞膜，细胞膜表面抗原不适合选择通透实验)

 
步骤

1. 通透：加入 0.1–0.25 % Triton X-100 (PBS 配制)，覆盖细胞，室温下通透 5-10 min ；
2. 洗涤：使用 PBS 缓冲液清洗 3 次，以去除残留通透液。

Tips:

通透剂的浓度和孵育时间应针对所用样品进行优化。

Section.04
第四步: 封闭

目的

封闭液中的成分能够与细胞表面的非特异性位点结合，从而阻止抗体与这些位点的非特异性结合。

封闭液的选择

可以选择与二抗相同来源的血清或者 BSA 等，例如，若二抗为山羊抗小鼠，应选择山羊血清作为封闭剂。

步骤

使用 2-10% 的 BSA/山羊血清，室温或 37 ℃ 封闭 1 h。

Tips:

1. 封闭溶液不应含有一抗的宿主动物血清，因为这可能会导致高背景。
2. 注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。

Section.05
第五步: 抗体孵育

目的

使抗体充分与目的蛋白抗原结合，决定了荧光信号的位置和特异性，进而影响实验结果的准确性和可靠性。

注意：该步骤可选择 (i) 直接检测，一抗直接与荧光基团偶联。(ii) 间接检测，使用合适的荧光标记二抗检测一抗。这两种方法各有优点和缺点，其中，间接检测是最常用的检测方法。

抗体的选择

1. 单染：一抗要选择任一宿主来源的抗体，二抗选择对应的抗一抗宿主的抗体。例如，一抗是小鼠来源，二抗要选择抗小鼠的抗体 (如山羊抗小鼠，驴抗小鼠等)。
2. 双染/多染：在进行多个荧光标记实验时，一抗要选择不同宿主来源的抗体，二抗选择对应的抗一抗宿主的抗体。同时要注意选择具有高区分度的荧光二抗，避免荧光重叠。例如，在进行三色荧光标记时，一般选用绿色、蓝色和红色这三种荧光基团，以确保每个信号都能被清晰地区分出来。

步骤
(以间接检测为例)：

1. 一抗孵育：根据研目标抗原和样品特性选择符合要求的一抗，并按照说明书要求稀释一抗，加入到样品中并在 4 ℃ 条件下孵育过夜 (12~16 h)。
2. 洗涤：回收一抗工作液，用 TBST/PBST 摇床缓慢清洗 3 次，每次 5~10 min，以去除未结合的抗体。洗涤次数和时间可根据实验条件调整。
3. 二抗孵育：根据一抗的种类及样品特性 (二抗携带的荧光需要与样品自带荧光不冲突) 选择合适的荧光标记的二抗，在室温下避光孵育 1 h。稀释和使用方法应遵循说明书。
4. 洗涤：去除/回收二抗工作液，用 TBST/PBST 摇床缓慢清洗 3 次，每次 5 ~ 10 min，以去除未结合的抗体。洗涤次数和时间可根据实验条件调整。

Tips:

1. 孵育荧光二抗之后，一定要注意避光保存！
2. 确定合适的二抗工作浓度浓度，避免无信号或背景过高现象的发生；
3. 注意湿盒的保湿效果，避免样品的干燥；
4. 洗涤时转速要温和，防止细胞脱片。

Section.06
第六步: 复染

目的

使用染色剂对细胞核进行染色，直观地区分细胞核和其他细胞及抗原结构的位置，便于观察和解读实验结果。

步骤

在清洗完毕的细胞中滴加 DAPI，室温避光静置约 30 s。

Section.07
第七步：封片

目的

保护已经染色的样本，防止其受到外界环境的损害。同时，封片还有助于保存实验结果，便于后续的分析和比较。

步骤

1. 封片：向载玻片上加入一滴封片剂，将盖玻片缓慢扣在载玻片上，细胞所在面靠近载玻片，用吸水纸吸除多余封片剂。
2. 观察：轻轻用指甲油密封盖玻片四周，避免样品在显微镜下移动。指甲油干透后，直接观察或 4 ℃ 下避光保存。

Tips:

1. 避免气泡：在封片过程中，需要避免产生气泡。气泡会干扰显微镜下的观察，影响实验结果的准确性。因此，在滴加封片液时，需要缓慢而均匀地滴加，并用镊子轻轻调整盖玻片的位置，以确保没有气泡产生。
2. 选择合适的封片剂：封片剂的选择也很重要。常用的封片剂包括缓冲甘油、抗荧光淬灭封片液等。在选择封片剂时，需要根据实验的具体需求和标本的特性进行选择。
3. 保持避光和湿度：封片后，需要将标本放置在避光和湿度适宜的环境中保存。这可以有效地防止荧光信号的淬灭和标本的干燥，确保实验结果的稳定性和准确性。
4. 细胞样品在封片剂处理后，理论上可以在 -20℃/4℃ 冰箱保存 1 周。然而，为了成像清晰和高荧光强度，建议尽快进行成像分析。

Section.08
第八步: 观察

成像及分析：在荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察并采集图像，并对荧光定位及结果进行实验分析。

怎么样？有没有跃跃欲试的小念头？让我们再来看看科研人的期刊文献中的免疫荧光 (IF) 成果图吧！

图 4. 亚细胞结构免疫荧光图^[1]。

好啦，朋友们，到这里细胞免疫荧光实验就结束啦！你学会了吗？从准备样本开始，一步步进行固定和抗体孵育，再到最后在显微镜下看到那些闪闪发光的细胞，真的超有成就感！

[1] Thul PJ, et al. A subcellular map of the human proteome. Science. 2017 May 26;356(6340):eaal3321.