细胞活力检测方法盘点：MTT，CCK-8，ATP发光检测法
2025-11-07 来源:本站 点击次数:85Section.01
细胞活力检测大PK
常用的细胞活力检测主要有 MTT、CCK8、Cell-ATP (CTG) 检测法等。首先，我们先来简单看下这些检测方法的原理、操作流程及优缺点~
方法 1：MTT 法
MTT法：又称 MTT 比色法。
原理
活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性 MTT 还原为不溶于水的蓝紫色结晶甲臜 (Formazan) 并沉积在细胞中，但死细胞无此功能，后经 DMSO 溶解，于 490 nm 处测定吸光值便可间接反应细胞活力。
流程
MTT 作为“元老”级别的检测方法，虽然“老练”，Paper 无数，但麻烦是真麻烦。当然，该方法除去操作步骤耗时以外，生成的 Formazan 是不溶于水的，需经 DMSO 溶解后才能检测，增加了工作量的同时仍不能保证测定结果的准确性，且该溶剂对人体具有明显毒性。
方法 2：CCK8 法
相较于 MTT，CCK8 法无论是操作步骤还是检测时间都优化了很多！
原理
CCK8 是一种基于 WST-8 而广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速、高灵敏度、无放射性的比色检测方法(可看往期推文 CCK-8，让细胞活性检测 So Easy!)。
流程
具体操作如下图所示: 1) 96 孔板中每孔加入 10 μL 的 CCK-8 溶液 (注意不要产生气泡); 2) 培养箱培养 1-4 h (避免放在培养箱边缘位置); 3) 酶标仪测定在 450 nm 处的吸光度。
案例
不同浓度 KN93 和 Gemcitabine 对 CCLP1 cell 活力的影响
- 细胞系: CCLP1 cells
- 培养条件: DMEM+10%FBS+1% amphotericin B/penicillin/streptomycin,1-2 h 后取样检测
- 实验结果: KN93 可增强 Gemcitabine 对 CCLP1 细胞的敏感性
图 1. KN93 和 Gemcitabine 对 CCLP1 细胞活力影响[1]。CCK-8 检测细胞活力发现 KN93 可以增强 Gemcitabine 对 CCLP1 的敏感性。
但在实验时，一直有个问题让人很困扰——“细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅”，但这个颜色深浅的标准我 “标” 不出来怎么办？痛点！痛点！痛点！
莫慌~试试 ATP 发光法细胞活力检测！简单、灵敏、快速，反应 10 分钟即可得到“Bling Bling”的检测结果，堪称细胞活力检测的"金标准"！
方法 3：ATP 发光法
ATP 发光法基于高灵敏度生物发光检测技术，通过对三磷酸腺苷 (ATP) 进行定量以测定培养物中活细胞数目及细胞活力。
原理
荧光素酶以荧光素、三磷酸腺苷 (ATP) 和 O2 为底物，在 Mg2+ 存在时，可将化学能转化为光能。在荧光素酶催化的发光反应中，ATP 在一定的浓度范围内，其浓度与发光强度呈线性关系。此方法不受化合物自发荧光的影响。
流程
具体操作如下：
1) 取出细胞培养板，室温平衡 10 min;
2) 96 孔板中每孔直接加入 100 μL Cell-ATP 检测试剂;
3) 室温振荡混匀 2 min，以促进细胞充分裂解;
4) 室温孵育 10 min (可根据预实验结果调整孵育时间)，使发光信号趋于稳定;
5) 使用具有检测化学发光功能的多功能酶标仪进行化学发光测定 (检测参数可根据仪器类型及检测灵敏度适当调整)。
该实验方法可用三个字简单概括 “快、准、狠”，比 MTT 的处理速度快近 20 倍，节省时间近 4 小时。ATP 特有的均质检测法即 “加样-混样-检测”，使用时，只需将本试剂等体积添加至培养细胞中即可进行检测。不用感慨，细胞活力检测为什么不能如此简单？
表 1. MTT、CCK8 与 ATP 法特点比较
Section.02
ATP 发光法, 适用于哪些实验?
首先，ATP 作为细胞新陈代谢的一个重要指标，与活细胞数目呈良好的线性关系，是细胞活力检测的重要标志性分子。
ATP 生物发光法的原理为：荧光素酶以荧光素、ATP 和 O2 为底物，在 Mg2+ 存在时，可将化学能转化为光能；在荧光素酶催化的发光反应中，ATP 在一定的浓度范围内，其浓度与发光强度呈线性关系，即在光信号与酶反应体系中，发光值与 ATP 呈正比，ATP 与活细胞数成正比，ATP 发光法通过 ATP 含量来进行细胞计数或活力测定，且不受化合物自发荧光的影响 (图 2)，是细胞增殖测定，细胞活力测定和细胞毒性高通量筛选分析的理想选择。
图 2. ATP 发光法检测原理 案例 1：细胞增殖测定
如图 3 所示，为了探究 SIPL1 对 TNBC 细胞增殖的影响，将 SIPL1 表达载体转染至 BT-549 与 MDA-MB-231 细胞， 并使用 CCK8 法与 ATP 法，进行细胞增殖检测。
- CCK-8 检测：TNBC 细胞瞬时转染 shRNA 或过表达质粒并培养 24 h 后检测。
- ATP 发光细胞活力测定：TNBC 细胞在 37°C 下培养过夜。然后，将 100 μL ATP 发光法活力检测试剂直接与培养基混合，在室温下培养 20 分钟。结果显示，转染靶向 SIPL1 shRNAs 的 BT-549 和 MDA-MB-231 细胞系的细胞增殖显著降低 (图 3)。
图 3. SIPL1 对 TNBC 细胞活力的影响[2]。CCK-8 (a) 和 ATP 发光细胞活力测定 (b) 用指示载体转导 BT-549 和 MDA-MB-231 细胞增殖能力的分析。
案例 2：细胞活力测定
如图 4 所示，为了探究外源 RRM2 是否会影响肝癌细胞的铁死亡，在 HepG2 和 SMMC-7721 细胞中过表达或敲除 RRM2，通过 ATP 发光法检测其对细胞活力的影响。结果表明，过表达 RRM2 时，细胞活力明显增强，反之，敲除 RRM2 时，细胞活力明显降低[2]。
图 4. 通过 ATP 法测定 RRM2 对细胞活力的影响[3]。(a) 在体外表达或敲除 RRM2 的 HepG2 和 SMMC-7721 细胞中测量细胞死亡 (b) 和 4-HNE 水平 (c)，然后再用 Fer-1、ZVAD-FMK、Nec-1 或体外表达的 RRM2 进行进一步处理。细胞活力测定采用 ATP 发光细胞活力测定法。
案例 3：细胞毒性高通量筛选分析
如下图所示，作者团队报告了一种基于浓度-反应曲线的表型定量高通量筛选 (qHTS)，旨在识别对疟原虫肝脏和无性血期寄生虫具有活性的化合物 (图 5)。使用 SYBR Green 或荧光素酶来测试对寄生虫生长的抑制，共检测了 456,817 种化合物。
在 qHTS 之后，又分类选择了 4,253 种合成易处理的化合物，用于验证抗疟原虫活性和哺乳动物毒性。在 3 μM 和 1 μM 浓度下对化合物进行体外抗伯氏疟原虫肝期寄生虫的评估。其中使用 ATP 发光法评估了所有 4,253 种化合物对 HepG2 的细胞毒性。其中 255 种化合物对 HepG2 细胞表现出一定程度的生长细胞毒性，AC50 值 < 43 μM (随后被排除)。最终筛选出 994 种经过验证的无毒性化合物，用于针对肝阶段寄生虫的后续评估。
图 5. 针对恶性疟原虫无性血期寄生虫的定量高通量筛选[4]。Section.03
ATP 发光法活力检测
图 6. MCE Cell-ATP Viability Detection Kit 与同类产品（竞品）对比测试结果。a. 产品发光稳定性测试（293T 细胞)；b. 不同细胞数的线性范围比较 (293T 细胞)；c. 不同细胞系的检测结果比较 (293T、H4IIE、Jurkat 细胞)
对比测试结果表明：持续 3 h 的生物发光稳定性的检测中，MCE Cell-ATP 检测试剂 的发光信号值比较稳定 (图 6a)；不同细胞数的线性范围中，MCE 产品线性关系良好，与进口 竞品线性几乎一致 (图 6b)；且对于不同细胞系，MCE 产品与进口竞品检测信号值相当 (图 6c)。综上检测结果表明，MCE ATP 发光法细胞活力检测试剂盒可实现稳定、灵敏、批次间差异较小的不同细胞系的细胞活力检测。
表 2. MCE Cell-ATP 检测试剂盒产品特性
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实验小 Tips，附上 ATP 法使用注意事项，希望你能早日发 SCI 啦。
1. 荧光素酶的活性对温度较为敏感，反复冻融会致其逐渐失活，建议分装冻存，避免反复冻融。冻融时，可能会导致试剂中出现少量沉淀，可平衡至室温后观测沉淀溶解情况，如仍有残留，可离心后去除。
2. 本产品在使用或分装时所使用耗材应注意避免 ATP 污染。
3. 若待测药物的溶剂含量较高，荧光素酶反应可能会被干扰，致化学发光信号受到影响，可设置含有溶剂的细胞培养液的对照孔以排除此干扰。
4. 检测时需使用适合于细胞培养的白色或黑色的多孔板 (96 孔板或 384 孔板)，普通透明多孔板的相邻孔之间可能会产生相互干扰。如使用透明板，可使用不透明的白色胶带粘贴孔底。
5. 建议在避光环境下进行荧光检测。
6. 由于整个发光反应非常迅速，建议加入 ATP 发光法细胞活力检测试剂孵育 10 分钟后，立即检测荧光。
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[1] Fu Y, et al. Alpha5 nicotine acetylcholine receptor subunit promotes intrahepatic cholangiocarcinoma metastasis. Signal Transduct Target Ther. 2024 Mar 8;9(1):63.
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