简介:

SCN5A基因编码Nav1.5通道，Nav1.5通道负责心肌细胞动作电位（AP）的除极和传导，该通道维持心脏正常的电生理功能。Nav1.5的功能缺失变异会降低钠电流密度（I_Na），并导致心脏传导阻滞或Brugada综合征等心律失常。目前对Nav1.5功能的调控机制尚未完全阐明。

基于此，武汉大学中南医院心内科鲁志兵教授团队与华中科技大学生命科学与技术学院王擎教授团队合作，在Cardiovascular Research发表题为“Coupling of USP10 de-ubiquitination and chaperone-mediated autophagy causes cardiac sodium channel degradation and cardiac arrhythmias”的研究论文。

本研究旨在鉴定与Nav1.5相互作用的新型蛋白质（去泛素化酶USP10），并阐明其对Nav1.5及心律失常的调控机制。

结论：
作者发现了一种新型伴侣介导的自噬(CMA)介导的通路，通过与USP10介导的Nav1.5 K430位点去泛素化作用相结合，调控Nav1.5的降解，从而导致内向钠电流密度降低和心脏传导异常。敲低USP10可缓解Scn5a+/−小鼠的心律失常，为治疗内向钠电流减少相关的心律失常提供了新治疗策略。

研究结果：

1. 将USP10鉴定为一种新型Nav1.5-interacting 蛋白，降低心脏钠电流密度及Nav1.5蛋白表达
为鉴定Nav1.5的新调控机制，研究人员以其胞质区域为猎物蛋白，通过GST下拉实验筛选小鼠心脏蛋白裂解液中的互作蛋白，在−130 kDa位置鉴定出去泛素化酶USP10，质谱分析及内源性Co-IP实验均证实二者互作。进一步通过构建USP10不同结构域表达质粒，结合Co-IP和GST下拉实验，明确Nav1.5与USP10的USP结构域而非N端相互作用，纯化蛋白实验验证了该互作的直接性。免疫荧光染色显示，USP10与Nav1.5在心肌细胞中共定位。综上，USP10通过其USP结构域与Nav1.5直接互作。

研究运用全细胞膜片钳技术探究USP10对Nav1.5的调控：在NRCMs、HEK293/Nav1.5细胞系及hESC-CMs中，过表达USP10均显著降低INa密度，NRCMs中失活曲线偏移而激活曲线无变化，HEK293/Nav1.5中该调控可被USP10 C424A突变消除，敲低USP10则INa密度升高。表达检测显示，USP10过表达降低Nav1.5蛋白总量及质膜表达，不影响Scn5a mRNA水平，敲低则提升其蛋白表达，证实USP10下调Nav1.5蛋白表达与INa密度。此外，研究发现心衰患者心脏中USP10蛋白表达较健康组显著增加。

图1. USP10被鉴定为Nav1.5的新型负调控蛋白

2. USP10过表达导致自发性心脏传导异常，并诱导小鼠出现室性心动过速
研究通过AAV9病毒递送系统在小鼠心脏过表达USP10，经qPCR、Western blot及免疫荧光验证，确认USP10成功过表达且感染效率超85%。遥测心电图显示，过表达小鼠P波持续时间、PR及QRS间期显著延长，出现自发性窦性停搏和房室传导阻滞，对照组无此现象；光学标测证实其窦性及起搏模式下激活时间延长、传导速度降低。程序性电刺激实验表明，过表达小鼠室性心动过速（VT）诱发率高，对照组未诱发。此外，氟卡尼未诱发VT，两组6个月均无自发性死亡，心功能无显著差异，综上USP10过表达导致小鼠心脏传导阻滞并诱发VT。

图2. USP10过表达导致小鼠心脏传导阻滞

3. USP10过表达改变了小鼠INa和ICa-L的密度和APD持续时间
研究分离USP10过表达的小鼠成年心室心肌细胞，检测其离子通道电流与动作电位：全细胞电压钳显示，小鼠心肌细胞INa密度显著降低且失活阈正向偏移，晚INa无变化，ICa-L密度降低但激活/失活特性不变，Ito、IK1、Iss无组间差异；在表达人源钾通道的HEK293细胞中，USP10也不影响人类Ito、IKr特性。动作电位检测发现，静息膜电位无差异，但APA、Vmax、APD90和APD50均降低，提示INa降低与传导异常相关，ICa-L减少或致APD降低。此外，USP10过表达显著降低小鼠心脏Nav1.5蛋白表达，而相关心律失常离子通道基因mRNA表达无差异。

图3. USP10过表达改变小鼠离子通道特性

4. 敲低USP10可恢复Scn5a+/−小鼠的钠电流减少及心律失常
研究利用CRISPR-Cas9构建Scn5a+/−小鼠并注射AAV9-shRNA-USP10或对照载体，发现Scn5a+/−小鼠Nav1.5蛋白表达、INa 及 ICa-L 密度均显著降低，Ito、IK1、Iss 电流无差异。注射AAV9-shRNA-USP10后，小鼠Nav1.5蛋白表达、INa 密度回升，ICa-L 密度恢复至野生型水平，AP参数也恢复正常。遥测心电图显示其传导异常改善，室性早搏消失，证实体内敲低USP10可通过恢复INa和ICa-L密度，减轻Scn5a+/−小鼠的心脏传导异常。

图4. USP10基因敲除恢复了Scn5a杂合敲除小鼠中降低的I_Na和I_Cal-L

图5. 使用shRNA敲低USP10可减轻Scn5a^+/−小鼠的心律失常

5. USP10通过CMA促进Nav1.5降解，Nav1.5基序EKRFQ431—435位于环I中，参与CMA介导的Nav1.5降解
研究探究USP10降低Nav1.5蛋白表达的机制：USP10不影响Scn5a的转录与翻译，而是通过降低Nav1.5蛋白稳定性促进其降解。蛋白酶体抑制剂MG132无作用，巨自噬抑制剂亦不影响，仅自噬抑制剂氯喹可阻断该效应，且抑制CMA关键分子LAMP2A或HSC70能阻碍USP10功能，证实依赖CMA途径。Co-IP显示Nav1.5与HSC70相互作用，其环I的EKRFQ431-435基序为关键结合位点，该基序突变可阻断互作、恢复Nav1.5表达及INa密度，表明Nav1.5是CMA底物，此基序介导其CMA降解。

图6. USP10通过分子伴侣介导的自噬促进Nav1.5降解

6. USP10介导的Nav1.5 K430位点去泛素化促进Nav1.5的CMA降解
研究探究USP10促进Nav1.5的CMA降解机制：因Nav1.5的 EKRFQ431-435基序紧邻USP10结合位点K430，推测其影响 Nav1.5与HSC70的结合，实验证实过表达USP10可显著增强二者结合。进一步发现USP10 能降低Nav1.5泛素化水平，经突变实验验证，K430是其去泛素化的关键位点，K430R突变可阻断该作用，还能抑制USP10对Nav1.5表达及INa密度的下调效应，揭示了去泛素化与 CMA偶联降解Nav1.5的新机制。

图7. USP10对Nav1.5 K430位点的去泛素化作用增强了CMA介导的Nav1.5降解