▶ 发表时间：2025年11月29日

▶ 期刊：《MedComm 》(IF=10.7)

▶ 发表团队：南方医科大学余林中课题组

▶ 文章标题：Discovery ofa Novel Non-Nucleoside Inhibitor of RNA-Dependent RNA Polymerase Against Dengue Virus

▶ 核心内容：

登革病毒（DENV）是全球分布最广的蚊媒病毒之一，每年导致数亿人感染，数万例死亡，目前尚无特异性抗病毒药物获批。病毒编码的RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）是病毒基因组复制的核心酶，因其在宿主细胞中无同源蛋白而成为理想的抗病毒靶点。近日，南方医科大学研究团队在《MedComm》发表论文，报道从中药三七中分离的天然化合物12β-hydroxydammar-3-one-20(S)-O-β-D-glucopyranoside（PN-1），可特异性靶向RdRp并有效抑制病毒复制，为抗登革病毒药物研发提供了新型先导化合物。

 

研究方法
研究团队首先采用表面等离子共振技术，对14种三七来源的达玛烷型三萜皂苷进行筛选，发现PN-1与DENV-2 RdRp的结合亲和力最高，平衡解离常数KD 为1.42 nM。通过等温滴定量热法、细胞热转移实验及药物亲和反应靶点稳定性实验，进一步证实PN-1可直接与病毒非结构蛋白5（NS5）的RdRp结构域结合，且不影响其甲基转移酶结构域功能。

 

研究结果
1.PN-1通过共价修饰调控抑制RdRp活性
液相色谱-串联质谱分析表明，PN-1通过其裂解片段共价修饰RdRp上的四个保守氨基酸残基：Glu255、Met387、Glu479和Ala507。定点突变实验证实，这些位点的突变显著减弱PN-1与RdRp的结合能力(图2.A-E)。
 

图2. PN-1共价修饰到RdRp蛋白的LCMSMS谱图

（A,C 体内非修饰肽段，B.PN-1修饰到Glu255肽段二级谱图, D. PN-1修饰到Ala507肽段二级谱图，E.对四个位点突变后显著减少PN-1与RdRp蛋白结合）

 

2.PN-1通过构象调控抑制RdRp活性

HDX-MS氢氘交换质谱分析显示，PN-1处理后，RdRp在多个结构区域的氢氘交换速率发生显著变化，尤其是在拇指结构域（肽段485–501与501–505）的交换率降低，提示该区域构象趋于稳定或封闭（图3）。色氨酸荧光光谱也观察到PN-1引起RdRp内源荧光猝灭，进一步支持其诱导蛋白质构象变化的结论（图2F）。这些构象改变最终导致RdRp酶活抑制，其半抑制浓度为6.10 μM。

图3. PN-1结合并调控RdRp构象

 

3.PN-1在体外与体内模型中表现广谱抗病毒活性

PN-1在多种细胞系中均能显著抑制DENV-2复制，降低病毒RNA、蛋白表达及病毒斑块形成。作用阶段分析表明，PN-1主要作用于病毒复制早期，对病毒吸附与进入过程无影响。此外，PN-1对DENV-1和DENV-3同样具有抑制活性，提示其具备跨血清型抗病毒潜力。在ICR鼠和AG129小鼠模型中，PN-1治疗能显著缓解病毒感染引起的体重下降、临床症状及组织病理损伤，并提高存活率（图4）。在AG129小鼠中，PN-1还可降低血清病毒载量，减轻肝脏、小肠和结肠的病理损伤。
 

图4. PN-1处理显著降低因病毒DENV-2引起的AG129小鼠生存危机

 

4.氢氘交换质谱HDXMS在机制阐释中的关键作用

本研究通过HDX-MS技术，从蛋白质构象动力学层面揭示了PN-1的作用机制。该技术通过监测蛋白质肽键氢与氘的交换速率，反映蛋白质局部结构的动态性与溶剂可及性。

实验结果显示：

交换率降低的区域：主要位于拇指（thumb)结构域及部分指掌区，提示PN-1结合后这些区域构象更稳定或更封闭，可能与活性口袋变构调控有关；

交换率升高的区域：分布于其他指(finger)掌(palm)区段，提示局部结构可能变得更动态或更暴露。这些数据不仅证实PN-1与RdRp发生物理结合，更重要的是阐明其通过变构调控机制改变酶的功能构象，从而抑制其催化活性。

HDX-MS所提供的动态结构信息，为理解PN-1作为非核苷类抑制剂的分子机制提供了直接证据。

PN-1作为首个被发现可通过共价修饰RdRp并变构调控其功能的天然来源非核苷类抑制剂，具有广谱应用潜力。由于RdRp在RNA病毒中相对保守，提示PN-1可能对黄病毒科其他成员（如寨卡病毒、丙肝病毒）也具有抑制活性。