DNA甲基化决定小鼠雄性生殖细胞发育过程中的组蛋白修饰
2026-02-03 来源:本站 点击次数:53
近日，国际权威期刊《Nucleic Acids Research》发表了题为“DNA methylation dictates histone modifications in developing male germ cells in the mouse”的研究论文，对小鼠雄性生殖细胞发育过程中DNA甲基化与组蛋白修饰（H3K9me3和H3K4me3）在逆转录转座子沉默中的调控关系进行了系统研究。具体来说，研究通过比较野生型、去甲基化酶Dnmt3l敲除（de novo甲基化缺失）和piRNA生物发生关键基因Pld6（piRNA缺失）的小鼠模型，结合mRNA-seq、全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）和染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）等多组学测序技术，精准评估了精原细胞中逆转录转座子的转录、DNA甲基化及组蛋白修饰（H3K9me3和H3K4me3）状态并揭示了在雄性精子发生过程中（尤其精母细胞阶段），DNA甲基化是决定组蛋白修饰（维持抑制性H3K9me3，抑制激活性H3K4me3）和维持表观基因组完整性的关键调控因子。
英文标题：DNA methylation dictates histone modifications in developing male germ cells in the mouse
中文标题：DNA甲基化决定小鼠雄性生殖细胞发育过程中的组蛋白修饰
发表时间：2025-11-20
发表期刊：Nucleic Acids Research
影响因子：IF13.1/Q1
技术平台：mRNA-seq、WGBS、ChIP-seq等
DOI:10.1093/nar/gkaf1240
在哺乳动物雄性生殖细胞中，逆转录转座子表达受DNA甲基化、组蛋白修饰H3K9me3和PIWI互作小RNA（piRNA）共同调控。为阐明上述机制在生殖细胞发育过程中调控逆转录转座子的相对重要性及相互关系，研究团队利用Dnmt3l突变体和Pld6突变体小鼠出生后第7天（P7）精原细胞和P21细线期/偶线期（L/Z）精母细胞进行mRNA测序、DNA甲基化和组蛋白甲基化的多组学测序分析。结果显示，DNA甲基化缺失导致年轻LINE-1（L1）亚家族中H3K9me3水平降低，并在大多数逆转录转座子中引起H3K4me3水平升高，表明DNA甲基化在维持精原细胞及精子发生后期阶段的表观基因组完整性中发挥着关键作用，且DNA甲基化缺失导致的逆转录转座子转录上调在生殖细胞减数分裂期（精母细胞）比减数分裂前（精原细胞）更为显著。上述结果与精母细胞中逆转录转座子H3K9me3整体降低结果一致。此外，即使piRNA存在，DNA甲基化缺失仍导致相同逆转录转座子位点的H3K9me3降低和H3K4me3升高，表明piRNA系统也可能通过调控DNA甲基化在精原细胞中调控逆转录转座子的H3K9me3和H3K4me3水平。
易小结
本研究在雄性生殖细胞表观遗传学领域具有重要意义，不仅系统揭示了piRNA通过指导DNA甲基化以影响H3K9me3的层级关系，还阐明表观遗传沉默网络在生殖细胞发育阶段中进行动态切换和相互协调。该成果为理解哺乳动物如何确保配子基因组的稳定性和正确继承，以及相关不育症、转座子激活相关疾病的机制提供了关键见解。
研究中WGBS和ChIP-seq（易基因金牌技术）等表观基因组测序技术的综合应用，建立了从DNA修饰到组蛋白修饰的多维度表观组图谱，为后续研究提供了技术思路，展现了高通量测序在解析发育表观遗传动态中的关键作用。
研究方法
（1）小鼠模型与细胞分选
结果图形
（1）部分逆转录转座子在Pld6和Dnmt3l敲除精原细胞中表达上调
研究首先通过mRNA-seq分析了P7精原细胞中逆转录转座子的表达谱。在Pld6KO突变体中（图1A），进化上较年轻的L1亚家族显著激活：L1Md_A_5end（包含启动子、5'UTR和ORF1）上调40倍，L1_Mm_orf2和L1Md_A_3end分别上调12倍，L1Md_Gf_5end上调7倍。同时，内源性A型颗粒（IAP）和MMERGLN家族的年轻LTR逆转录转座子也分别上调达25倍和37倍。提示在Pld6KO（piRNA缺失）中，以L1Md_A_5end（年轻L1亚家族）和IAPEz/MMERGLN（年轻LTR）为代表的部分逆转录转座子表达显著上调。
相比之下，Dnmt3lKO精原细胞（图1C）表现出不同的激活模式：IAP和MMERGLN家族表现出更剧烈的转录激活（60-140倍），且与精母细胞中的激活程度相当；然而，L1亚家族的激活程度显著较低（仅4-14倍），远低于其在Dnmt3lKO精母细胞中的激活水平（39-127倍）。
通过对比两种突变体（图1E），研究发现Dnmt3lKO中IAP元件的激活程度高于Pld6KO，表明在精原细胞阶段，DNA甲基化是LTR元件沉默的主要机制，而L1元件仍受piRNA系统的有效调控。这一结果提示，在发育过程中，逆转录转座子沉默从piRNA依赖的后转录调控向DNA甲基化依赖性转录调控发生转变。
（2）单个逆转录转座子拷贝的DNA甲基化水平降低
为深入解析DNA甲基化的位点特异性变化，研究利用高覆盖度WGBS数据（约7×和11×基因组覆盖）对单个L1拷贝的启动子区域（5'端，含串联重复单体）进行分析。分析结果显示，在Dnmt3lKO中，大多数L1拷贝的甲基化水平显著降低（图2B）。而在Pld6KO中，L1群体呈现显著双峰分布（图2A）：一群保持高甲基化（Pld6非依赖性），另一群则显著去甲基化（Pld6依赖性）。进一步分析表明，Pld6依赖性位点主要对应进化上较年轻的L1Md_A和L1Md_Gf亚家族，而较成熟的拷贝保持高甲基化（图2C），这与SPOCD1-SPINC1-piRNA系统特异性靶向年轻L1启动子的机制一致。
对于IAP元件的LTR区域（IAPLTR1_Mm），Pld6KO并未导致整体甲基化水平显著下降（图2D），仅个别位点出现去甲基化，提示piRNA对IAP的调控具有位点特异性。但在Dnmt3lKO中，研究观察到显著差异：5'和3' LTR保持高甲基化，而solo LTR（不含内部序列的孤立LTR）则出现严重去甲基化（图3A-C）。这种差异并非由局部GC含量导致（图3D），而是源于原始生殖细胞（E13.5 PGCs）阶段的全基因组去甲基化抵抗，完整IAP元件的5'/3' LTR在PGCs中保持高甲基化，而solo LTR则被去甲基化（图3E）。因此，Dnmt3lKO精原细胞中的IAP甲基化模式反映了PGCs阶段的“记忆”，表明de novo甲基化在精原细胞阶段对solo LTR的de novo甲基化至关重要。
WGBS不仅证实了两种突变体中DNA甲基化的整体丢失，还为理解piRNA和DNA甲基化对特定转座子亚群和特定位点的特异性调控提供了直接证据。
（3）DNA甲基化缺失导致进化上年轻的L1亚家族H3K9me3水平降低
为探究DNA甲基化与组蛋白修饰之间的因果关系，研究者进行了H3K9me3的ChIP-seq分析。ChIP-seq数据显示，在Pld6KO和Dnmt3lKO精原细胞中，之前被WGBS鉴定为“Pld6依赖”的（即piRNA和DNA甲基化同时丢失的）年轻L1启动子位点，其H3K9me3水平均显著下降（图4A）。而在两种突变体中DNA甲基化都丢失的IAP、MMERVK10C和MMERGLN等LTR位点，其H3K9me3却基本不受影响（图4B-D）。这一发现至关重要，表明DNA甲基化可以维持年轻L1位点（而非所有转座子）的H3K9me3水平。结合ChIP-seq（图6A）和WGBS（图3E）数据，研究者推断年轻L1拷贝在PGCs阶段已获得H3K9me3标记，但在发育过程中，DNA甲基化丢失会导致该抑制性标记丢失，提示了DNA甲基化对H3K9me3的维持作用。
（4）DNA甲基化缺失导致逆转录转座子H3K4me3水平增加
此外，研究者对激活性组蛋白标记H3K4me3进行了ChIP-seq分析。ChIP-seq数据明确显示，在Pld6KO和Dnmt3lKO中，所有DNA甲基化降低的逆转录转座子位点，无论是年轻的L1（图4A、5C-D）还是IAP、MMERVK10C、MMERGLN等LTR元件（图4B-D），其H3K4me3水平均显著增加。这揭示了DNA甲基化的另一个关键功能：抑制激活性组蛋白标记H3K4me3。结合发育数据（图6B），这些位点在精原细胞期H3K4me3水平本来较低，但由于甲基化丢失导致其异常增加，可能进一步促进转录激活。H3K4me3的ChIP-seq分析完美补充了H3K9me3数据，共同描绘DNA甲基化如何双向调控组蛋白修饰谱：维持抑制性（H3K9me3）并抑制激活性（H3K4me3），从而确保转座子沉默。
（5）精母细胞中逆转录转座子的H3K9me3水平降低
为理解不同发育阶段的调控差异，研究者对L/Z期精母细胞也进行了H3K9me3和H3K4me3的ChIP-seq分析，并与P7精原细胞的ChIP-seq数据进行比较分析。ChIP-seq数据显示，与精原细胞相比，野生型精母细胞中大部分逆转录转座子（如L1Md_A_5end和IAPLTR1_Mm）的H3K9me3水平普遍降低，而H3K4me3水平略有上升（图8A-B）。尽管两种突变体在精原细胞和精母细胞中引起的组蛋白修饰变化倍数相似（图8C-F），但精母细胞中本就较低的H3K9me3基础水平，介导DNA甲基化丢失造成的去抑制效应（转录上调）在精母细胞阶段表现得比精原细胞阶段更为显著（图1F）。
上述研究结果表明，在生殖细胞发育过程中，表观遗传调控重心从主要依赖piRNA（在精原细胞中有效调控L1）转向主要依赖DNA甲基化（在精母细胞中对所有转座子类型都更为关键），这与精母细胞中H3.1/H3.2被不稳定的H3t替换等染色质环境改变相适应。
结论和启示
本研究通过ChIP-seq+WGBS+RNA-seq等分析揭示了DNA甲基化在小鼠雄性生殖细胞发育过程中对组蛋白修饰（如H3K9me3和H3K4me3）具有决定性调控作用。具体而言，piRNA通路通过指导DNA的de novo甲基化以介导年轻L1转座子沉默，而DNA甲基化则负责维持这些位点H3K9me3并抑制H3K4me3。对于LTR转座子，DNA甲基化则主要负责抑制H3K4me3。随着发育进程变化，表观遗传沉默网络更依赖DNA甲基化，这一转变确保在精子发生后期，即使组蛋白改变，转座子也能长期有效抑制，从而保障配子基因组稳定遗传。
ChIP-seq和WGBS在本研究中的重要作用
ChIP-seq：在全基因组范围内动态绘制特定组蛋白修饰（H3K9me3和H3K4me3）的分布图谱，直接证明DNA甲基化丢失如何导致年轻L1位点H3K9me3降低，以及所有丢失甲基化位点H3K4me3增加，揭示了DNA甲基化对组蛋白修饰的调控作用。同时通过比较精原细胞与精母细胞的ChIP-seq数据，阐明了组蛋白修饰景观的发育动态变化。
WGBS：提供的CpG位点单碱基分辨率DNA甲基化全谱图，不仅验证了两种突变体模型中逆转录转座子的整体甲基化丢失，更通过量化的甲基化水平分析，精确定义哪些是“Pld6依赖”和“Pld6不依赖”位点，以及IAP的全长LTR与solo LTR甲基化差异。
ChIP-seq和WGBS的结合，清晰地刻画出了“DNA甲基化丢失→H3K9me3下调&H3K4me3上调→转录激活→基因组稳定性受损”的完整证据链。
参考文献：Sugimoto H, Kawase M, Ichiyanagi K. DNA methylation dictates histone modifications in developing male germ cells in the mouse. Nucleic Acids Res. 2025 Nov 13;53(21) doi: 10.1093/nar/gkaf1240.
英文标题：DNA methylation dictates histone modifications in developing male germ cells in the mouse
中文标题：DNA甲基化决定小鼠雄性生殖细胞发育过程中的组蛋白修饰
发表时间：2025-11-20
发表期刊：Nucleic Acids Research
影响因子：IF13.1/Q1
技术平台：mRNA-seq、WGBS、ChIP-seq等
DOI:10.1093/nar/gkaf1240
在哺乳动物雄性生殖细胞中，逆转录转座子表达受DNA甲基化、组蛋白修饰H3K9me3和PIWI互作小RNA（piRNA）共同调控。为阐明上述机制在生殖细胞发育过程中调控逆转录转座子的相对重要性及相互关系，研究团队利用Dnmt3l突变体和Pld6突变体小鼠出生后第7天（P7）精原细胞和P21细线期/偶线期（L/Z）精母细胞进行mRNA测序、DNA甲基化和组蛋白甲基化的多组学测序分析。结果显示，DNA甲基化缺失导致年轻LINE-1（L1）亚家族中H3K9me3水平降低，并在大多数逆转录转座子中引起H3K4me3水平升高，表明DNA甲基化在维持精原细胞及精子发生后期阶段的表观基因组完整性中发挥着关键作用，且DNA甲基化缺失导致的逆转录转座子转录上调在生殖细胞减数分裂期（精母细胞）比减数分裂前（精原细胞）更为显著。上述结果与精母细胞中逆转录转座子H3K9me3整体降低结果一致。此外，即使piRNA存在，DNA甲基化缺失仍导致相同逆转录转座子位点的H3K9me3降低和H3K4me3升高，表明piRNA系统也可能通过调控DNA甲基化在精原细胞中调控逆转录转座子的H3K9me3和H3K4me3水平。
图形摘要
易小结
本研究在雄性生殖细胞表观遗传学领域具有重要意义，不仅系统揭示了piRNA通过指导DNA甲基化以影响H3K9me3的层级关系，还阐明表观遗传沉默网络在生殖细胞发育阶段中进行动态切换和相互协调。该成果为理解哺乳动物如何确保配子基因组的稳定性和正确继承，以及相关不育症、转座子激活相关疾病的机制提供了关键见解。
研究中WGBS和ChIP-seq（易基因金牌技术）等表观基因组测序技术的综合应用，建立了从DNA修饰到组蛋白修饰的多维度表观组图谱，为后续研究提供了技术思路，展现了高通量测序在解析发育表观遗传动态中的关键作用。
研究方法
（1）小鼠模型与细胞分选
- Dnmt3l敲除（KO） 和Pld6敲除（KO） 小鼠分别作为DNA de novo甲基化和piRNA生物发生缺失模型。
- 从出生后第7天（P7）的小鼠睾丸中分选出EpCAM阳性的精原细胞。从P21小鼠中分选出细线期/偶线期（L/Z）的精母细胞。
- 从野生型、杂合子和纯合子KO小鼠的精原细胞中提取RNA进行mRNA-seq测序分析，评估小鼠特异性逆转录转座子各亚家族的表达水平。
- 从野生型和Pld6KO精原细胞中提取基因组DNA，进行WGBS测序分析，计算每个CpG位点的甲基化水平，并分析逆转录转座子位点的DNA甲基化状态。
- 利用H3K9me3和H3K4me3抗体对P7精原细胞和P21的L/Z期精母细胞进行ChIP-seq测序分析，计算逆转录转座子位点的ChIP富集度。
结果图形
（1）部分逆转录转座子在Pld6和Dnmt3l敲除精原细胞中表达上调
研究首先通过mRNA-seq分析了P7精原细胞中逆转录转座子的表达谱。在Pld6KO突变体中（图1A），进化上较年轻的L1亚家族显著激活：L1Md_A_5end（包含启动子、5'UTR和ORF1）上调40倍，L1_Mm_orf2和L1Md_A_3end分别上调12倍，L1Md_Gf_5end上调7倍。同时，内源性A型颗粒（IAP）和MMERGLN家族的年轻LTR逆转录转座子也分别上调达25倍和37倍。提示在Pld6KO（piRNA缺失）中，以L1Md_A_5end（年轻L1亚家族）和IAPEz/MMERGLN（年轻LTR）为代表的部分逆转录转座子表达显著上调。
相比之下，Dnmt3lKO精原细胞（图1C）表现出不同的激活模式：IAP和MMERGLN家族表现出更剧烈的转录激活（60-140倍），且与精母细胞中的激活程度相当；然而，L1亚家族的激活程度显著较低（仅4-14倍），远低于其在Dnmt3lKO精母细胞中的激活水平（39-127倍）。
通过对比两种突变体（图1E），研究发现Dnmt3lKO中IAP元件的激活程度高于Pld6KO，表明在精原细胞阶段，DNA甲基化是LTR元件沉默的主要机制，而L1元件仍受piRNA系统的有效调控。这一结果提示，在发育过程中，逆转录转座子沉默从piRNA依赖的后转录调控向DNA甲基化依赖性转录调控发生转变。
图1：突变体中逆转录转座子的RNA表达。
（2）单个逆转录转座子拷贝的DNA甲基化水平降低
为深入解析DNA甲基化的位点特异性变化，研究利用高覆盖度WGBS数据（约7×和11×基因组覆盖）对单个L1拷贝的启动子区域（5'端，含串联重复单体）进行分析。分析结果显示，在Dnmt3lKO中，大多数L1拷贝的甲基化水平显著降低（图2B）。而在Pld6KO中，L1群体呈现显著双峰分布（图2A）：一群保持高甲基化（Pld6非依赖性），另一群则显著去甲基化（Pld6依赖性）。进一步分析表明，Pld6依赖性位点主要对应进化上较年轻的L1Md_A和L1Md_Gf亚家族，而较成熟的拷贝保持高甲基化（图2C），这与SPOCD1-SPINC1-piRNA系统特异性靶向年轻L1启动子的机制一致。
对于IAP元件的LTR区域（IAPLTR1_Mm），Pld6KO并未导致整体甲基化水平显著下降（图2D），仅个别位点出现去甲基化，提示piRNA对IAP的调控具有位点特异性。但在Dnmt3lKO中，研究观察到显著差异：5'和3' LTR保持高甲基化，而solo LTR（不含内部序列的孤立LTR）则出现严重去甲基化（图3A-C）。这种差异并非由局部GC含量导致（图3D），而是源于原始生殖细胞（E13.5 PGCs）阶段的全基因组去甲基化抵抗，完整IAP元件的5'/3' LTR在PGCs中保持高甲基化，而solo LTR则被去甲基化（图3E）。因此，Dnmt3lKO精原细胞中的IAP甲基化模式反映了PGCs阶段的“记忆”，表明de novo甲基化在精原细胞阶段对solo LTR的de novo甲基化至关重要。
WGBS不仅证实了两种突变体中DNA甲基化的整体丢失，还为理解piRNA和DNA甲基化对特定转座子亚群和特定位点的特异性调控提供了直接证据。
图2：突变体中逆转录转座子的DNA甲基化。
图3：IAP LTR序列的DNA甲基化。
（3）DNA甲基化缺失导致进化上年轻的L1亚家族H3K9me3水平降低
为探究DNA甲基化与组蛋白修饰之间的因果关系，研究者进行了H3K9me3的ChIP-seq分析。ChIP-seq数据显示，在Pld6KO和Dnmt3lKO精原细胞中，之前被WGBS鉴定为“Pld6依赖”的（即piRNA和DNA甲基化同时丢失的）年轻L1启动子位点，其H3K9me3水平均显著下降（图4A）。而在两种突变体中DNA甲基化都丢失的IAP、MMERVK10C和MMERGLN等LTR位点，其H3K9me3却基本不受影响（图4B-D）。这一发现至关重要，表明DNA甲基化可以维持年轻L1位点（而非所有转座子）的H3K9me3水平。结合ChIP-seq（图6A）和WGBS（图3E）数据，研究者推断年轻L1拷贝在PGCs阶段已获得H3K9me3标记，但在发育过程中，DNA甲基化丢失会导致该抑制性标记丢失，提示了DNA甲基化对H3K9me3的维持作用。
图4：突变体精原细胞中逆转录转座子位点的H3K9me3和H3K4me3修饰水平。
（4）DNA甲基化缺失导致逆转录转座子H3K4me3水平增加
此外，研究者对激活性组蛋白标记H3K4me3进行了ChIP-seq分析。ChIP-seq数据明确显示，在Pld6KO和Dnmt3lKO中，所有DNA甲基化降低的逆转录转座子位点，无论是年轻的L1（图4A、5C-D）还是IAP、MMERVK10C、MMERGLN等LTR元件（图4B-D），其H3K4me3水平均显著增加。这揭示了DNA甲基化的另一个关键功能：抑制激活性组蛋白标记H3K4me3。结合发育数据（图6B），这些位点在精原细胞期H3K4me3水平本来较低，但由于甲基化丢失导致其异常增加，可能进一步促进转录激活。H3K4me3的ChIP-seq分析完美补充了H3K9me3数据，共同描绘DNA甲基化如何双向调控组蛋白修饰谱：维持抑制性（H3K9me3）并抑制激活性（H3K4me3），从而确保转座子沉默。
图5：L1主要区域的H3K9me3和H3K4me3水平（亚家族水平分析）。
图6：发育过程中Pld6依赖性L1拷贝的组蛋白甲基化修饰。
图7：Setdb1、Dnmt3l和Pld6基因敲除突变效应的比较（亚家族水平分析）。
（5）精母细胞中逆转录转座子的H3K9me3水平降低
为理解不同发育阶段的调控差异，研究者对L/Z期精母细胞也进行了H3K9me3和H3K4me3的ChIP-seq分析，并与P7精原细胞的ChIP-seq数据进行比较分析。ChIP-seq数据显示，与精原细胞相比，野生型精母细胞中大部分逆转录转座子（如L1Md_A_5end和IAPLTR1_Mm）的H3K9me3水平普遍降低，而H3K4me3水平略有上升（图8A-B）。尽管两种突变体在精原细胞和精母细胞中引起的组蛋白修饰变化倍数相似（图8C-F），但精母细胞中本就较低的H3K9me3基础水平，介导DNA甲基化丢失造成的去抑制效应（转录上调）在精母细胞阶段表现得比精原细胞阶段更为显著（图1F）。
上述研究结果表明，在生殖细胞发育过程中，表观遗传调控重心从主要依赖piRNA（在精原细胞中有效调控L1）转向主要依赖DNA甲基化（在精母细胞中对所有转座子类型都更为关键），这与精母细胞中H3.1/H3.2被不稳定的H3t替换等染色质环境改变相适应。
图8：P7精原细胞和P21精母细胞中的H3K9me3和H3K4me3水平（亚家族水平分析）
结论和启示
本研究通过ChIP-seq+WGBS+RNA-seq等分析揭示了DNA甲基化在小鼠雄性生殖细胞发育过程中对组蛋白修饰（如H3K9me3和H3K4me3）具有决定性调控作用。具体而言，piRNA通路通过指导DNA的de novo甲基化以介导年轻L1转座子沉默，而DNA甲基化则负责维持这些位点H3K9me3并抑制H3K4me3。对于LTR转座子，DNA甲基化则主要负责抑制H3K4me3。随着发育进程变化，表观遗传沉默网络更依赖DNA甲基化，这一转变确保在精子发生后期，即使组蛋白改变，转座子也能长期有效抑制，从而保障配子基因组稳定遗传。
ChIP-seq和WGBS在本研究中的重要作用
ChIP-seq：在全基因组范围内动态绘制特定组蛋白修饰（H3K9me3和H3K4me3）的分布图谱，直接证明DNA甲基化丢失如何导致年轻L1位点H3K9me3降低，以及所有丢失甲基化位点H3K4me3增加，揭示了DNA甲基化对组蛋白修饰的调控作用。同时通过比较精原细胞与精母细胞的ChIP-seq数据，阐明了组蛋白修饰景观的发育动态变化。
WGBS：提供的CpG位点单碱基分辨率DNA甲基化全谱图，不仅验证了两种突变体模型中逆转录转座子的整体甲基化丢失，更通过量化的甲基化水平分析，精确定义哪些是“Pld6依赖”和“Pld6不依赖”位点，以及IAP的全长LTR与solo LTR甲基化差异。
ChIP-seq和WGBS的结合，清晰地刻画出了“DNA甲基化丢失→H3K9me3下调&H3K4me3上调→转录激活→基因组稳定性受损”的完整证据链。
参考文献：Sugimoto H, Kawase M, Ichiyanagi K. DNA methylation dictates histone modifications in developing male germ cells in the mouse. Nucleic Acids Res. 2025 Nov 13;53(21) doi: 10.1093/nar/gkaf1240.
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