人类肾脏类器官源自人多能干细胞（hPS细胞），在再生医学中展现出巨大潜力，但大规模生产类器官同时确保分化保真度的技术仍面临挑战。本文报道了一种可扩展、可重复且经济高效的方法，用于从hPS细胞衍生肾脏类器官（hPSC肾脏类器官），并通过单细胞RNA测序、共聚焦图像分析、代谢测定和CRISPR-Cas9工程等技术，证明这些类器官在细胞间接触后表现出转录多样性和细胞组成。研究团队将人类肾脏类器官注入离体猪肾脏中，利用常温机器灌注（NMP）技术，展示了hPSC肾脏类器官在体内的移植能力，并评估了免疫反应，证实了该方法的可行性和存活率。通过原位杂交、免疫组织化学、共聚焦显微镜、图像分析和定量、体内成像以及流式细胞术等技术，在NMP和体内移植后鉴定出人源细胞。这项工作为在临床试验中使用hPSC肾脏类器官进行离体细胞治疗奠定了基础。

重要发现者包括Elena Garreta、Daniel Moya-Rull、Alberto Centeno、Andrés Marco、Asier Ullate-Agote、Gaia Amato、Carlos J. Aranda、Roger Oria、Daniel Lozano-Ojalvo、Merel B. F. Pool、Tim L. Hamelink、Idoia Lucia Selfa、Federico Gonzalez、Carolina Tarantino、Alejandro Montero Salinas、Patricia Lopez San Martin、Priyanka Koshy、Aleix Gavalda-Navarro、Amaia Vilas-Zornoza、Juan R. Rodriguez-Madoz、Anton Fernández Garcia、Inmaculada Marquez-Leiva、Henri G. D. Leuvenink、Cristobal Belda-Iniesta、Maarten Naesens、Beatriz Dominguez-Gil、Marcelino Gonzalez-Martin、Javier Rodriguez-Rivera、Jordi Ochando、Felipe Prosper、Cyril Moers和Nuria Montserrat。他们发表的文章题为“Systematic production of human kidney organoids for transplantation in porcine kidneys during ex vivo machine perfusion”，于2025年10月在《Nature Biomedical Engineering》上在线发表。

重要发现
01类器官的生成与表征
研究团队首先开发了一种可扩展的方法，从hPS细胞生成肾脏类器官。通过优化细胞间接触条件，发现以500个PIM定向细胞聚集形成的类器官表现出更高的分化特征，包括更丰富的肾小球样和肾小管样结构。单细胞RNA测序分析显示，这些类器官包含肾内皮样、间充质样、增殖样、足细胞样和小管样细胞群，且细胞组成均匀。共聚焦显微镜图像证实了类器官的分段肾单位结构，例如表达PODXL和WT1的肾小球样区域，以及表达LTL的近端小管样区域。

代谢分析进一步表明，500个细胞聚集的类器官表现出更高的氧化磷酸化（OXPHOS）生物能量谱，这驱动了近端小管分化。Seahorse分析显示，与更大规模聚集的类器官相比，这些小规模类器官的氧消耗率更高，表明其代谢状态更接近成熟肾脏。流式细胞术和图像定量分析验证了近端小管标记物LTL的阳性细胞比例较高，突出了细胞间接触在促进分化中的作用。

02移植实验与成像技术
在离体实验中，研究团队使用常温机器灌注（NMP）系统将人类肾脏类器官注入猪肾脏。通过荧光标记（如Xenolight近红外染料）类器官，利用体内成像系统（IVIS）进行实时监测。结果显示，类器官在灌注后均匀分布在肾脏皮质区域，且移植后24小时和48小时仍可检测到荧光信号，表明类器官存活并整合。

共聚焦显微镜和原位杂交技术用于鉴定人源细胞（如Alu重复序列），证实类器官在肾小球和血管结构中存在。免疫组织化学分析显示，移植后类器官表达肾小管标记物（如ECAD和LTL），且损伤标记物KIM-1表达较低，说明移植过程未引起严重炎症反应。流式细胞术进一步定量了Xenolight阳性细胞的比例，验证了成像数据的可靠性。

03免疫反应评估
研究还通过流式细胞术和Luminex assay评估了移植后的免疫反应。结果显示，移植组与对照组在T淋巴细胞（CD3+、CD4+、CD8+）和单核细胞比例上无显著差异，且细胞增殖标记物Ki-67表达未发生变化。细胞因子（如IL-6和IL-10）水平也保持稳定，表明人类类器官在猪肾脏中未引发明显的异种免疫排斥。组织学分析中，CD68+和CD45+细胞在肾小球和小管区分布均匀，进一步支持了移植的安全性。

创新与亮点
01突破成像难题
本研究突破了肾脏类器官移植后实时监测的成像难题。传统方法难以在活体环境中跟踪类器官的存活和整合，而通过结合荧光报告基因（如WT1-GFP）和近红外成像技术，实现了对类器官的高灵敏度、无创监测。例如，CRISPR-Cas9工程生成的WT1-GFP报告细胞线允许在类器官分化过程中实时可视化足细胞样细胞的动态变化，这为优化分化条件提供了直观工具。

02新成像技术的应用
研究团队开发了多模态成像策略，整合了共聚焦显微镜、IVIS光学成像和流式细胞术，从而在微观和宏观层面全面评估类器官移植效果。共聚焦图像提供了细胞级别的结构信息，而IVIS成像实现了整个器官的荧光信号定量，这种组合提高了数据的可靠性和可重复性。此外，原位杂交和免疫荧光技术的结合，使得人源细胞在复杂组织中的定位更加精确。

总结与展望
本研究成功开发了一种可扩展的肾脏类器官生产方法，并通过离体常温机器灌注和体内移植实验，证实了人类类器官在猪肾脏中的存活和整合能力。成像技术的创新，如荧光报告基因和多模态成像，实现了对类器官动态过程的高效监测，突破了传统方法的局限。这些成果为肾脏疾病的细胞治疗提供了新思路，尤其是在器官移植前预处理方面展现出广阔前景。未来，研究可进一步探索类器官在更长移植时间点的功能恢复效果，并结合基因编辑技术优化类器官的免疫兼容性。最终，这项技术有望推动个性化肾脏再生治疗进入临床实践，造福终末期肾病患者。

DOI:10.1038/s41551-025-01542-1.