siRNA 和 shRNA 到底咋选？
 做基因沉默实验，先把这俩区别搞懂 做分子生物学实验，基因沉默是绕不开的操作，而 siRNA 和 shRNA 就是实现这个目的的两大核心工具。刚进实验室那会，我也傻傻分不清楚，第一次做实验随便选了 siRNA，结果想做长期沉默却发现效果几天就没了，白忙活大半个月。后来跟着师姐摸透了两者的门道，才发现选对工具比硬做实验重要多了。 其实本质上，siRNA 和 shRNA 都是通过RNA 干扰（RNAi） 机制降解靶基因的 mRNA，从而抑制蛋白表达，但两者的结构、制备方式、适用场景天差地别。结合实验室的实操经验，把这俩的核心区别和选择逻辑讲清楚，新手看完就能直接套用。
一、核心定义：一个是 “现成子弹”，一个是 “造子弹的生产线” 先从最基础的结构和本质说起，这是理解两者区别的关键，别被专业术语绕晕，通俗点讲就是： siRNA（小干扰 RNA） 是化学合成的双链小分子 RNA，长度一般 21-23 个核苷酸，两条链互补配对，没有额外的结构。你可以把它理解成 “工厂预制好的子弹”，直接买回来就能用，不需要自己改造，作用机制是直接与细胞内的 RNA 诱导沉默复合物（RISC）结合，靶向降解 mRNA。 shRNA（短发夹 RNA） 是带有茎环（发夹）结构的单链 RNA，长度一般 50-80 个核苷酸，由互补的正义链、反义链和中间的环序列组成。它不是 “现成的”，需要先把编码 shRNA 的 DNA 序列克隆到载体（质粒、慢病毒、腺病毒等）中，再将载体导入细胞，由细胞内的 RNA 聚合酶 Ⅲ（如 U6、H1 启动子驱动）转录生成 shRNA，随后被核酸酶切割成类似 siRNA 的双链结构，再发挥沉默作用。简单说，shRNA 是 “在细胞内造子弹的生产线”，先建生产线，再持续产子弹。
二、关键区别：6 个维度讲透，实验选哪个一看就懂 这是最核心的部分，我把实验室里最关心的 6 个维度整理成了表格，对比起来一目了然，比纯文字好记多了： 对比维度 siRNA shRNA 制备方式 化学合成，

对比维度	siRNA	shRNA
制备方式	化学合成，直接购买成品	分子克隆构建载体（质粒 / 病毒），需自行制备或定制
转染 / 递送方式	脂质体、电转等直接转染细胞	载体转染 / 病毒感染（慢病毒最常用，可感染难转染细胞）
沉默时效	短期沉默，效果一般持续 3-7 天	长期稳定沉默，整合到细胞基因组后可永久表达
靶向特异性	脱靶效应相对较高（化学合成的批次差异可能影响）	脱靶效应更低（载体表达的 shRNA 更稳定，可优化序列）
适用细胞类型	主要适用于易转染的贴壁细胞（如 HeLa、293T）	适用于所有细胞，包括难转染的悬浮细胞、原代细胞
实验成本	单次实验成本低，无需构建载体	前期构建载体 / 包装病毒成本高，后期稳转细胞系可重复使用

三、实操选择：根据实验目的定，别盲目选！ 选 siRNA 还是 shRNA，核心看你的实验需要短期沉默还是长期沉默，以及细胞类型好不好转染，这是实验室前辈总结的 “黄金选择原则”，亲测有效： 选 siRNA 的情况 实验目的是快速验证基因功能：比如想看看敲低某个基因后，细胞的增殖、凋亡短期内有没有变化，siRNA3 天就能看到效果，省时省力。 做高通量筛选：比如筛选某个通路中的关键基因，需要同时沉默几十个基因，化学合成的 siRNA 可以批量购买，直接转染即可，不用一个个构建 shRNA 载体。 细胞是易转染的贴壁细胞：比如 293T、HepG2、MCF-7 等，脂质体转染效率就能达到 80% 以上，没必要折腾 shRNA。 选 shRNA 的情况 实验需要长期稳定沉默基因：比如构建稳转细胞系，研究基因的长期功能，或者做裸鼠成瘤、体内实验，siRNA 的短期效果根本满足不了，必须用 shRNA（尤其是慢病毒载体介导的 shRNA，能整合到细胞基因组，代代相传）。 细胞是难转染类型：比如原代细胞、免疫细胞、悬浮肿瘤细胞（如 K562），脂质体转染 siRNA 的效率几乎为 0，这时慢病毒包装的 shRNA 是唯一选择，感染效率能达到 90% 以上。 想做诱导性沉默：比如某些基因敲低后会导致细胞死亡，无法获得稳转细胞系，这时可以用四环素诱导的 shRNA 载体，加入诱导剂后才表达 shRNA，实现时空特异性沉默。 四、新手避坑小贴士：这几个细节别踩雷 siRNA 实验别贪高浓度：很多新手觉得浓度越高，沉默效果越好，结果反而脱靶效应剧增，还会对细胞产生毒性。建议先做浓度梯度实验（10nM、50nM、100nM），找到最优沉默浓度，一般 50nM 左右效果最好。 shRNA 靶序列设计是关键：别随便找个序列就克隆，一定要用专业的在线工具（如 siDirect、RNAi Designer）设计，避开基因的突变位点、重复序列，还要做 blast 比对，确保不靶向其他基因。
慢病毒包装要注意生物安全：用慢病毒载体做 shRNA 时，包装过程需要在生物安全二级实验室进行，操作时戴好手套、口罩，避免病毒泄露，新手最好在有经验的师兄师姐指导下做。
验证沉默效果要做 “双重验证”：不管用 siRNA 还是 shRNA，都要先通过 qPCR 验证 mRNA 水平的沉默效率，再用 WB 验证蛋白水平，只看其中一项容易出现假阳性。 最后总结一下 简单来说，siRNA 适合短期、快速、高通量的基因沉默实验，操作简单、成本低
；shRNA 适合长期、稳定、难转染细胞或体内的基因沉默实验，操作复杂、成本高，但适用性更广。