在全球医药监管日益严格的背景下，欧洲药典（EP，European Pharmacopoeia）对抗生素的热原检测要求不断更新。许多品种的方法已从传统的家兔热原检测法（RPT，Rabbit Pyrogen Test）转变为细菌内毒素检测法（BET，Bacterial Endotoxin Test）。

然而，仅使用BET法可能不足以完全控制热原风险，非内毒素热原（NEP）的“隐形威胁”是当前合规申报的核心挑战，这也是单核细胞活化试验法（MAT）被推上风口的关键原因之一。

一、法规更新的时间线
（1）2025年7月1日起
EP 11.8补编版正式删除家兔热原法（RPT），MAT成为唯一被推荐的替代方法^[1]。

（2）2025年8月
EP 12版本再次强调：

• EP5.1.13致热原性章节规定“仅用BET必须提供排除NEP的风险评估”。
• EP2.6.30章节把MAT列为可检测所有热原（含内毒素和非内毒素）的药典方法。

（3）2026年开始
欧洲药品质量管理局（EDQM）现场核查已把“有无NEP控制策略”列入高频缺陷项。

二、抗生素中热原检测发展历史概述
EP第三版（1997年版）抗生素热原检测主要以RPT为主，自1986年《欧洲动物保护公约》通过以来，欧洲药典委员会加速开展体外替代方法的应用，以便响应3R原则（减少、优化、替代动物试验）的推进。

表1.抗生素热原检测RPT转变为BET列表^[2]

表2.抗生素热原检测RPT未转变为BET列表

EP已正式废除RPT，并明确将MAT作为首选替代方法。那么未完成RPT替换的品种该如何锚定适配的热原检测方法？已完成BET替代的49种抗生素，是否就真正实现了热原防控的 “高枕无忧”？

EP5.1.13致热原性一般性章节中给出答案：

• 只有在排除非内毒素热原性物质存在的情况下，BET法才适用；
• 如果选择BET作为检测特定产品致热原性的唯一方法，则必须对潜在的NEP进行风险评估；
• 若无法排除NEP的存在，则应使用MAT；
• 对于已获批工艺，建议评估其潜在的NEP风险。一旦生产工艺发生变更，也须开展NEP风险评估，并将报告随变更申请一并提交。

三、抗生素申报合规风险，非内毒素热原恰好是“高发区”
抗生素生产的复杂工艺本身，就是NEP的潜在引入点。从上游发酵的原材料与代谢产物，到下游纯化与设备清洁的每个关键步骤，均需进行前瞻性的风险评估。只有对全过程进行系统审视，才能构建起针对NEP的全面防控体系。

图1.抗生素发酵和回收工艺^[4]

风险评估内容—存在非内毒素热原（NEP）的可能性有多大？

1. 生产工艺用菌株的特性：使用菌为G+或G-，评估是否可能含有脂磷壁酸（LTA）或肽聚糖等热原成分；评估特定蛋白表达水平（例外毒素、其他蛋白质）
2. 发酵工艺残留革兰阳性菌（HKSA、LTA）、肽聚糖、酵母多糖等，都属于NEP。这些杂质与LPS协同刺激，可放大细胞因子含量，临床引发放大热原反应
3. 评估培养基成分及来源：动物源性（是否存在病毒）、植物源性（是否存在霉菌毒素或是否为合成途径）
4. 原材料的生物负载
5. 生产工艺中潜在的交叉污染以及环境监测
6. 下游工艺去除热原的能力

• 用有机溶剂进行提取过程，该溶剂能溶解目标化合物但不会溶解水溶性热原物质
• 过滤工艺用于分离如蛋白质或DNA/RNA等分子量较高的物质
• 通过使用强酸或强碱来改变pH值，这可能会破坏某些热原物质（即目标化合物是稳定的）

EP11.8补编 2.6.30-6.5章节中关于NEP方法验证要求：

（1）预实验应包括使用至少2种NEP配体（如肽聚糖、脂磷壁酸、合成细菌脂蛋白、鞭毛蛋白等）对检测系统进行验证，其中至少1种需加标至待检制剂中。

（2）如有历史批次中已证实受NEP污染物污染的阳性样品，可优先使用；如无则可选择生产工艺可能引入的NEP对检测系统进行验证。
告别合规盲区，抗生素药品的合规热原检测

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表3.PyroSup™ 热原检测试剂盒（MAT法）—试剂盒样品适用性

PyroSup™热原检测试剂盒（单核细胞活化反应测定MAT法）
 

• 合规性与申报基石：细胞来源清晰，已获得商业授权，规避申报合规风险。
• 监管认可与性能稳定：联合权威机构进行全面性能验证，并经过客户及监管机构测试，其质量与性能优于其他同类型产品。
• 强大的技术解决能力：该细胞具备优异的技术适用性，搭配针对性前处理方案，可轻松突破检测场景限制。
• 经过实证的成功案例：已成功支持多个产品完成欧盟/FDA上市申报，拥有成熟的申报经验。
• 资质认证：通过ISO13485质量管理体系认证和CNAS实验室认可，拥有中、美、欧三地申报丰富经验。

参考文献
[1] Europaea, P. (2025) 2.6.30. Monocyte-activation test-11.8.
[2] Source: EDQM; Animal Welfare Progress; PA/PH/SG (07) 8
[3] Europaea, P. (2020) 2.6.30. Monocyte-activation test
[4] Dr. Uwe Lipke | Phasing out the rabbit pyrogen test – the view from the perspective of antibiotics | 15.02.2023 9