Arrayjet生物芯片点样仪助力适配体小分子靶点的高通量筛选
2026-01-30 来源:本站 点击次数:145
RNA适配体与小分子染料结合后会显著增强荧光，提高信噪比，在RNA成像领域展现出巨大潜力。目前已开发出多种荧光RNA适配体，包括Spinach、Broccoli、Mango、Corn、Pepper等。通常情况下，这些适配体可结合多种小分子染料，应用于细胞成像研究，包括多色RNA成像、单分子光谱分析以及构建检测传感器。
Mango RNA适配体是一种高亲和力的核糖核苷酸适配体，这种适配体以纳摩尔亲和力结合一种噻唑橙荧光团衍生物(TO1-biotin)，使荧光强度提高数倍。Mango RNA适配体由39个核苷酸组成，相对于其他荧光适配体其碱基长度较短，可轻易进行设计和编码改造。X射线晶体结构研究表明，这类适配体可折叠成含G - 四链体的复杂结构，通过将TO荧光团限制在平面构象中实现荧光增强。
RNA常作为小分子的重要靶点，但开发高效、高选择性的RNA小分子配体仍十分困难。片段导向设计是一种常用的研究方法，该方法从亲和力弱但特异性强的低分子量配体出发，快速开发出靶向目标的高亲和力、高特异性小分子结合剂。
本文通过片段导向微阵列筛选技术，以结构为导向发现了新一代 Mango II RNA适配体TO衍生荧光团。通过对Mango II–TO 结合口袋进行计算分析，识别了疏水区域、口袋体积及适合小分子结合的区域，进而将TO与特定小分子连接，合成出多种新型染料，其中一种（SALAD1）表现出亚纳摩尔级亲和力，且荧光强度比TO1–biotin高出3.5倍。
文章题目为“Structure-informed design of an ultrabright RNA-activated fluorophore”于2025年5月发表在Nature chemistry杂志，研究团队来自美国国家癌症研究所。
作者开发了一种独特的TO衍生荧光团，分析Mango适配体内部的配体结合口袋，并定性对比及MolSoft Pocketfinder 软件分析，研究Mango适配体中TO1类配体的结合模式（图1a），实现结合该适配体小分子的高通量筛选。
通过对 TO1-Mango II 复合物共晶结构分析，显示该配体结合口袋具有疏水性，且体积适合识别小分子配体。TO1 - 生物素与适配体结合时，会堆叠在鸟嘌呤四联体上并与 A12、A17 相互作用，而生物素侧链暴露于溶剂中，在晶体结构中未被解析。将不含生物素侧链的TO结构对接至Mango II适配体后，作者发现在口袋内存在一个空位。推测该空位可容纳一个独立片段分子，该分子可通过 TO上的甲基连接，进而有望改善结合效果（图1b）。
为高效筛选 TO 的共结合片段，作者开发了小分子微阵列（SMM），基于存在或不存在TO 配体的条件下筛选带标签的Mango适配体（图1c）。2214 个小分子片段均含有伯胺和羟基，可通过英国Arrayjet生物芯片点样仪将其固定到异氰酸酯修饰的载玻片上，形成SMM。
同时，带有多聚腺苷酸（polyA）尾的 Mango RNA用 Cy5 进行标记，与玻片进行孵育，观察存在TO以及不存在TO情况下的结合效果，并对每个斑点的荧光强度进行定量分析。Mango II 组与 Mango II+TO筛选结果的皮尔逊相关系数仅为 0.04，表明有无 TO 存在时，筛选得到的阳性化合物集合存在显著差异（图1d）。
共鉴定出30个片段（F1-F30）为 Mango II RNA 的结合阳性片段分子。其中11个分子与TO的结合无竞争性，其余19个为竞争性结合。作者推测部分非竞争性阳性分子可能结合于Mango适配体的可用口袋中（图1b）。
针对小分子微阵列筛选中发现的11个与TO呈非竞争性结合的片段，作者探究了这些分子是否会影响配体所发出的荧光。通过向 TO-Mango II 复合物溶液中滴定小分子溶液进行荧光强度测定实验。滴定在500 nM TO下进行，确保 Mango II口袋的结合达到完全饱和，记录荧光强度随片段浓度的变化数据，发现6个非竞争性片段（F1-F3、F5-F6、F10）能不同程度地增强 TO 荧光（增幅为 5% 至 116%），其余5个片段效果微弱或无明显作用（图2a）。值得注意的是，3 个具有荧光增强作用的片段（F1-F3）含有相似的化学结构。
此外，作者还测试了竞争性结合片段（包括3个代表性片段 F28-F30 以及2种已知的 G - 四链体（G4）堆叠配体 BRACO19 和 PhenDC3），它们在荧光实验中表现出竞争性结合特征。在所有片段中，F2（图2b）展现出最具潜力的荧光增强效果，其半数有效浓度（EC50）为 52±19 µM，荧光强度提升 95%，且 Z 值较高（图 2c）。
因此，作者选择F2进行后续研究。F2本身无荧光，这表明F2片段的结合是通过增强TO自身的荧光发挥作用。结果不仅验证了小分子微阵列筛选非竞争性配体的有效性，还首次发现非竞争性、非共价结合的配体能够增强TO的荧光。
随后作者通过多种方法表征了F2与TO-Mango II 复合物的结合情况。表面等离子体共振（SPR）实验中，将带有多聚腺苷酸（polyA）尾的 Mango II RNA 固定在链霉亲和素芯片表面（图2d）。分别给与500 µM F2 或1 µM TO 时，结合信号分别为 10±1 和 41±2 响应单位（RU）。同时给与TO 和 F2 时，观察到的结合水平为 52±4 RU，大致相当于单个组分结合响应的总和（图 2e），这证实了两者可同时结合。将 F2 滴定数据拟合至结合等温线，得到解离常数（KD）为 700±260 µM。平行实验中，样品先与饱和浓度（500 nM）的 TO 预平衡，再进行F2 滴定。
结果显示，TO存在时，F2的解离常数无显著变化（KD=450±120 µM），表明TO与RNA 的结合不会显著影响F2的结合。此外，荧光滴定实验也证实，F2 的结合不会改变TO与适配体的KD值。除此之外，还通过核磁共振（NMR）评估了F2的结合情况。配体峰的正相位信号表明存在结合相互作用（图 2f ）。实验结果显示，F2 仅在TO存在时与 Mango II RNA 结合。相反，缺失任一组分（TO 或 RNA）时，NMR 光谱呈现负相位，表明无相互作用发生。综上，这些结果证实F2占据的 RNA 结合位点与 TO 的结合位点不同。
该研究表明，通过小分子微阵列技术，可开发出性能更优的RNA 结合配体。作者发现了一个能与TO非竞争性结合Mango II 并增强其荧光强度的分子。将该分子与TO共价连接后，所得染料对适配体的亲和力达到亚纳摩尔级别。
SALAD1以独特方式结合Mango II，其特征是通过改变A22的构象形成更封闭的结合位点。该结合构象使羰基氧处于与钾离子成键的距离范围内，而该钾离子可稳定相邻鸟嘌呤四联体（G4）的中心。小分子配体能够将某个基团定位在 G4 钾离子的成键距离内，这种独特的结合相互作用可能为其他G4配体的设计提供启发。
SALAD1的独特性能及其特定分子相互作用，最终催生了一类亮度更高、实用性更强的 RNA 激活型荧光团。由于荧光亮度高且背景信号低，“Mango-SALAD” 系统非常适合共聚焦成像，有望为 RNA 表达与定位研究创造新的机会。本文所述的设计策略不仅对改良型成像探针（包括其他荧光激活 RNA 适配体）的开发具有指导意义，也为药物化学领域开发与治疗相关 RNA 相互作用的生物活性化合物提供了参考。
原文链接：https://doi.org/10.1038/s41557-025-01832-w
Arrayjet位于英国爱丁堡，专注于提供生物芯片应用领域的解决方案及服务。自2000年公司成立即致力于开发新型生物样品喷点方案–喷墨式液体处理平台，该系统于2006年上市，目前用户遍布全球27个国家。
Mercury系列产品采用独特的飞行喷墨点样技术实现行业第一的快速、非接触式微量液体处理。同时上万种不同样品可以进行快速点样，专利的上样模块配合高通量的点样喷头保障您的点样操作快速、无污染，更低的上样体积可有效减少样品损失，使您的珍贵样品物尽其用。该系列产品制备高密度的蛋白微阵列芯片、抗体微阵列芯片、糖微阵列芯片、小分子化合物微阵列芯片等，用于自身免疫抗体、生物标记物、候选疫苗或靶点的高通量筛选，疾病研究和新药研发等诸多科研和临床领域。
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Mango RNA适配体是一种高亲和力的核糖核苷酸适配体，这种适配体以纳摩尔亲和力结合一种噻唑橙荧光团衍生物(TO1-biotin)，使荧光强度提高数倍。Mango RNA适配体由39个核苷酸组成，相对于其他荧光适配体其碱基长度较短，可轻易进行设计和编码改造。X射线晶体结构研究表明，这类适配体可折叠成含G - 四链体的复杂结构，通过将TO荧光团限制在平面构象中实现荧光增强。
RNA常作为小分子的重要靶点，但开发高效、高选择性的RNA小分子配体仍十分困难。片段导向设计是一种常用的研究方法，该方法从亲和力弱但特异性强的低分子量配体出发，快速开发出靶向目标的高亲和力、高特异性小分子结合剂。
本文通过片段导向微阵列筛选技术，以结构为导向发现了新一代 Mango II RNA适配体TO衍生荧光团。通过对Mango II–TO 结合口袋进行计算分析，识别了疏水区域、口袋体积及适合小分子结合的区域，进而将TO与特定小分子连接，合成出多种新型染料，其中一种（SALAD1）表现出亚纳摩尔级亲和力，且荧光强度比TO1–biotin高出3.5倍。
文章题目为“Structure-informed design of an ultrabright RNA-activated fluorophore”于2025年5月发表在Nature chemistry杂志，研究团队来自美国国家癌症研究所。
作者开发了一种独特的TO衍生荧光团，分析Mango适配体内部的配体结合口袋，并定性对比及MolSoft Pocketfinder 软件分析，研究Mango适配体中TO1类配体的结合模式（图1a），实现结合该适配体小分子的高通量筛选。
通过对 TO1-Mango II 复合物共晶结构分析，显示该配体结合口袋具有疏水性，且体积适合识别小分子配体。TO1 - 生物素与适配体结合时，会堆叠在鸟嘌呤四联体上并与 A12、A17 相互作用，而生物素侧链暴露于溶剂中，在晶体结构中未被解析。将不含生物素侧链的TO结构对接至Mango II适配体后，作者发现在口袋内存在一个空位。推测该空位可容纳一个独立片段分子，该分子可通过 TO上的甲基连接，进而有望改善结合效果（图1b）。
为高效筛选 TO 的共结合片段，作者开发了小分子微阵列（SMM），基于存在或不存在TO 配体的条件下筛选带标签的Mango适配体（图1c）。2214 个小分子片段均含有伯胺和羟基，可通过英国Arrayjet生物芯片点样仪将其固定到异氰酸酯修饰的载玻片上，形成SMM。
同时，带有多聚腺苷酸（polyA）尾的 Mango RNA用 Cy5 进行标记，与玻片进行孵育，观察存在TO以及不存在TO情况下的结合效果，并对每个斑点的荧光强度进行定量分析。Mango II 组与 Mango II+TO筛选结果的皮尔逊相关系数仅为 0.04，表明有无 TO 存在时，筛选得到的阳性化合物集合存在显著差异（图1d）。
共鉴定出30个片段（F1-F30）为 Mango II RNA 的结合阳性片段分子。其中11个分子与TO的结合无竞争性，其余19个为竞争性结合。作者推测部分非竞争性阳性分子可能结合于Mango适配体的可用口袋中（图1b）。
图 1 | Mango 适配体的结构及片段结合特征a. TO 与 TO1 - 生物素的化学结构。b. 存在 TO 时，Mango II RNA 适配体的口袋模型分析。c. 基于片段微阵列（SMM）的筛选流程：使用 Cy5 标记的 Mango II RNA（250 nM），基于存在或不存在竞争性配体 TO（2.5 µM）的条件下进行筛选。每个样品均开展重复筛选。d. 不同孵育条件下（Mango II 组 vs Mango II+TO 组）各片段的 Z 值对比（Z 值阈值 = 3）。红线代表皮尔逊相关性拟合结果。蓝色圆点代表与 TO 呈竞争性结合的片段，红色圆点代表非竞争性结合片段。
针对小分子微阵列筛选中发现的11个与TO呈非竞争性结合的片段，作者探究了这些分子是否会影响配体所发出的荧光。通过向 TO-Mango II 复合物溶液中滴定小分子溶液进行荧光强度测定实验。滴定在500 nM TO下进行，确保 Mango II口袋的结合达到完全饱和，记录荧光强度随片段浓度的变化数据，发现6个非竞争性片段（F1-F3、F5-F6、F10）能不同程度地增强 TO 荧光（增幅为 5% 至 116%），其余5个片段效果微弱或无明显作用（图2a）。值得注意的是，3 个具有荧光增强作用的片段（F1-F3）含有相似的化学结构。
此外，作者还测试了竞争性结合片段（包括3个代表性片段 F28-F30 以及2种已知的 G - 四链体（G4）堆叠配体 BRACO19 和 PhenDC3），它们在荧光实验中表现出竞争性结合特征。在所有片段中，F2（图2b）展现出最具潜力的荧光增强效果，其半数有效浓度（EC50）为 52±19 µM，荧光强度提升 95%，且 Z 值较高（图 2c）。
因此，作者选择F2进行后续研究。F2本身无荧光，这表明F2片段的结合是通过增强TO自身的荧光发挥作用。结果不仅验证了小分子微阵列筛选非竞争性配体的有效性，还首次发现非竞争性、非共价结合的配体能够增强TO的荧光。
随后作者通过多种方法表征了F2与TO-Mango II 复合物的结合情况。表面等离子体共振（SPR）实验中，将带有多聚腺苷酸（polyA）尾的 Mango II RNA 固定在链霉亲和素芯片表面（图2d）。分别给与500 µM F2 或1 µM TO 时，结合信号分别为 10±1 和 41±2 响应单位（RU）。同时给与TO 和 F2 时，观察到的结合水平为 52±4 RU，大致相当于单个组分结合响应的总和（图 2e），这证实了两者可同时结合。将 F2 滴定数据拟合至结合等温线，得到解离常数（KD）为 700±260 µM。平行实验中，样品先与饱和浓度（500 nM）的 TO 预平衡，再进行F2 滴定。
结果显示，TO存在时，F2的解离常数无显著变化（KD=450±120 µM），表明TO与RNA 的结合不会显著影响F2的结合。此外，荧光滴定实验也证实，F2 的结合不会改变TO与适配体的KD值。除此之外，还通过核磁共振（NMR）评估了F2的结合情况。配体峰的正相位信号表明存在结合相互作用（图 2f ）。实验结果显示，F2 仅在TO存在时与 Mango II RNA 结合。相反，缺失任一组分（TO 或 RNA）时，NMR 光谱呈现负相位，表明无相互作用发生。综上，这些结果证实F2占据的 RNA 结合位点与 TO 的结合位点不同。
图 2 | 与 TO 共结合 RNA 的片段鉴定a. 荧光强度测定实验（激发波长 λex=510 nm；发射波长 λem=535 nm）：使用微阵列筛选发现的代表性非竞争性片段（F1-F3、F5、F6、F10）和竞争性片段（F28-F30）。数据以平均值 ± 标准差（mean±s.d.）表示，基于三次技术重复（n=3）。经典 G - 四链体（G4）结合剂 BRACO19 和 PhenDC3 用作实验的对照。在饱和浓度（500 nM）TO 存在下，向 Mango II RNA 中滴定片段。Mango II-TO 复合物的初始荧光强度被归一化为 1。片段滴定结果显示出荧光增强或淬灭效应。b、c. F2 的化学结构（b）及小分子微阵列（SMM）筛选结果（Z 值及斑点图像；c）。d. 分别针对 TO、F2 及 TO+F2 混合溶液的表面等离子体共振（SPR）结合实验。每个样品均进行三次重复实验，获得SPR结果图。e. SPR 结合定量分析。SPR 数据来自三次技术重复进样（n=3），柱状图数据以平均值 ± 标准差（mean±s.d.）表示。f. 水配体观察梯度光谱（waterLOGSY）核磁共振（NMR）实验：验证有无 TO 存在时 F2 与 Mango II RNA 的结合情况。N - 甲基缬氨酸（N–Me–Val–OH）用作非结合内参对照以作比较。
该研究表明，通过小分子微阵列技术，可开发出性能更优的RNA 结合配体。作者发现了一个能与TO非竞争性结合Mango II 并增强其荧光强度的分子。将该分子与TO共价连接后，所得染料对适配体的亲和力达到亚纳摩尔级别。
SALAD1以独特方式结合Mango II，其特征是通过改变A22的构象形成更封闭的结合位点。该结合构象使羰基氧处于与钾离子成键的距离范围内，而该钾离子可稳定相邻鸟嘌呤四联体（G4）的中心。小分子配体能够将某个基团定位在 G4 钾离子的成键距离内，这种独特的结合相互作用可能为其他G4配体的设计提供启发。
SALAD1的独特性能及其特定分子相互作用，最终催生了一类亮度更高、实用性更强的 RNA 激活型荧光团。由于荧光亮度高且背景信号低，“Mango-SALAD” 系统非常适合共聚焦成像，有望为 RNA 表达与定位研究创造新的机会。本文所述的设计策略不仅对改良型成像探针（包括其他荧光激活 RNA 适配体）的开发具有指导意义，也为药物化学领域开发与治疗相关 RNA 相互作用的生物活性化合物提供了参考。
原文链接：https://doi.org/10.1038/s41557-025-01832-w
Arrayjet位于英国爱丁堡，专注于提供生物芯片应用领域的解决方案及服务。自2000年公司成立即致力于开发新型生物样品喷点方案–喷墨式液体处理平台，该系统于2006年上市，目前用户遍布全球27个国家。
Mercury系列产品采用独特的飞行喷墨点样技术实现行业第一的快速、非接触式微量液体处理。同时上万种不同样品可以进行快速点样，专利的上样模块配合高通量的点样喷头保障您的点样操作快速、无污染，更低的上样体积可有效减少样品损失，使您的珍贵样品物尽其用。该系列产品制备高密度的蛋白微阵列芯片、抗体微阵列芯片、糖微阵列芯片、小分子化合物微阵列芯片等，用于自身免疫抗体、生物标记物、候选疫苗或靶点的高通量筛选，疾病研究和新药研发等诸多科研和临床领域。
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