期刊：Plant Methods
影响因子：4.4
通讯单位：华大基因
通讯作者：姜三杰
伯豪技术产品：伯优^®植物样本细胞核分离试剂盒

引言
植物单细胞测序困局：优化抽核方案如何重塑转录组学研究的精准度？
在植物生物学研究领域，单细胞转录组技术正以前所未有的分辨率揭示细胞异质性与基因调控网络的复杂性。然而，这项技术在植物样本中的应用仍面临诸多挑战：细胞壁的酶解效率、原生质体分离过程中的胁迫响应、不同组织类型的可及性差异，以及核转录组与全细胞转录组之间的系统性偏差，都让研究者们在实验设计和数据解读上面临着艰难抉择。

近日，发表于《Plant Methods》的一项研究为我们提供了一份详尽的路线图。来自多家机构的研究团队系统性地比较了玉米叶片和根尖组织中，基于原生质体、新鲜细胞核及冷冻细胞核的单细胞转录组学工作流程。值得注意的是，该研究通过使用优化的核制备方案——包括采用商品化细胞核制备试剂盒进行改良——成功克服了植物组织中核RNA-seq的多个技术瓶颈，为理解植物细胞异质性提供了更全面、更精准的视角。

主要产品
伯优^®植物样本细胞核分离试剂盒（技术产品伯豪生物提供）

主要研究
从“单细胞”到“单核”：植物转录组学的范式演进
植物细胞因其坚韧的细胞壁和液泡结构，使得完整的原生质体制备过程既是一门艺术，也是一种挑战。传统的原生质体分离虽然能捕获较为完整的转录组信息，但酶解过程不可避免会诱导应激基因的表达，且难以应用于木质化程度高或深层组织的研究。相比之下，单核RNA测序通过直接分离细胞核，规避了原生质体制备的诸多限制，尤其适用于难以解离的样本或需要进行空间转录组验证的研究场景。

本研究的核心贡献之一，在于其对核分离流程的系统性优化。研究团队在核分离缓冲液中添加了RNase抑制剂和DTT，以最大程度保持核内RNA的完整性。更重要的是，他们针对不同组织类型采用了差异化的纯化策略：对于富含次生代谢物和叶绿体的叶片样本，采用FANS分选获得高纯度细胞核；而对于结构相对简单的根尖组织，则采用密度梯度离心进行富集。这种精细化的操作不仅保证了核得率，更为后续高质量的测序数据奠定了基础。

数据质量：核转录组能否媲美原生质体？
对于习惯于全细胞转录组的研究者而言，核RNA-seq最令人担忧的问题莫过于数据质量的下降。本研究的测序数据给出了令人信服的答案。

在单细胞/单核水平上，研究团队使用了优化的DNBelab C4平台进行文库构建。从表2的统计数据可以看出，尽管原生质体样本在平均每个细胞检测到的基因数（如根原生质体达4,000以上）和UMI计数方面仍保持优势，但冷冻核样本的表现已相当可观。例如，根冷冻核样本平均检测到的基因数超过3,000，UMI计数超过5,000，这一指标显著优于新鲜核样本，且与以往发表的植物snRNA-seq研究相比处于较高水平。

这种提升直接归因于核分离流程的优化。在核分离过程中，使用含有高质量RNase抑制剂的缓冲液以及温和的研磨与纯化步骤，最大限度地减少了内源及外源RNase对RNA的降解。图4中基因体覆盖度曲线清晰地显示，虽然核样本相较于原生质体存在一定的3‘端偏好性（提示存在部分降解），但冷冻核样本的覆盖度曲线明显优于新鲜核样本，表明液氮速冻结合优化的分离流程能够更好地维持转录本完整性。

更重要的是，研究团队开发了一套与单细胞测序化学体系高度匹配的批量RNA-seq流程，为单核数据的解读提供了可靠的参考基准。表1的批量测序数据表明，核样本（尤其是冷冻核）的基因组比对率超过90%，基因比对率也达到60%以上。尽管核样本中不可避免地存在一定比例的rRNA污染（表S2，叶片FANS纯化的核样本rRNA比例为5.44%-9.09%），但这并不妨碍高质量的蛋白编码基因捕获。主成分分析（图4d）显示，不同制备方法的样本在相同组织内紧密聚集，证明优化后的核分离方案能够很好地保留组织特异的转录组特征。

图4. 不同样本制备类型的bulk RNA-seq文库评估

表2. 单细胞RNA-seq统计数据概览

图5. 叶片样本单细胞转录组数据的细胞类型注释及分布

图6. 根尖样本单细胞转录组数据的细胞类型及注释分布

解读挑战与应对策略：如何驾驭核转录组数据？
尽管核数据在细胞类型覆盖上具有优势，但其本身也带来了新的分析挑战。本研究的系统性评估为如何应对这些挑战提供了实用指南。

首先是TSO假象问题。由于核样本中mRNA丰度低、片段较短，反转录过程中容易产生非特异性扩增产物。研究团队展示了使用Cutadapt进行TSO序列去除的策略，成功识别并过滤了含有TSO串联体的reads（图S7），显著提升了数据利用率。

其次是背景噪音问题。由于核分离过程中可能会吸附环境中的游离RNA，核数据的背景噪音水平通常高于原生质体。图7c显示，SoupX估算的核样本污染比例（14%-52%）远高于原生质体样本（5%-7%）。为解决这一问题，研究团队尝试了CellBender进行背景校正。虽然校正后的数据（图S8）成功抑制了某些高丰度基因的污染，但也付出了灵敏度下降的代价，甚至丢失了原生质体中特有的某些细胞类型标记。这一发现提醒我们：背景校正工具的使用需要权衡利弊，尤其是在探索性研究中，直接丢弃背景或过度校正可能会掩盖真实的生物学信号。研究团队的建议是，当条件允许时，整合原生质体与核数据可能是构建完整、可靠的植物细胞图谱的最优策略。

图7. 不同样本制备方式转录组特征的质量评估与比较

转录因子表达：一个需要高度警惕的技术偏差
本研究的一个意外发现是，转录因子表达谱的聚类分析（图S5）显示，样本首先按制备方法（原生质体、新鲜核、冷冻核）聚类，而非按组织来源。这一现象揭示了不同分离方法对核内转录调控网络解析可能产生系统性影响。尽管研究团队未能找到显著富集的特定TF家族，但这仍然是一个值得高度关注的警告：在进行细胞身份注释或调控网络推断时，方法学本身引入的偏差可能会被误读为生物学差异。这进一步强调了在研究设计中保持方法一致性、以及在进行跨数据集比较时充分考虑技术变量的重要性。

结论
从玉米出发，走向更广阔的植物单细胞世界
本研究以玉米B73自交系为材料，通过系统性比较原生质体、新鲜核与冷冻核的工作流程，为植物单细胞转录组学提供了宝贵的实验指南。研究数据表明，优化的核分离方案——特别是基于高质量商品化试剂盒的改良流程——能够在保证数据质量的同时，显著提升对特定细胞类型（如维管束鞘细胞、根冠细胞）的捕获能力。

对于广大植物科研工作者而言，这项研究传递了几个关键信息：
原生质体仍然是追求最高灵敏度和转录本覆盖度的首选，尤其适用于研究叶肉细胞等易解离的细胞类型。

当研究目标涉及难以解离的深层组织、木质化细胞，或需要保留细胞的空间位置信息时，冷冻核样本结合优化的分离与纯化流程，是极佳且可靠的替代方案。

在有限条件下，新鲜核也可作为备选，但需严格遵守低温操作规范，并预期其数据质量（尤其是基因检出率）会略有下降。

转录因子表达等分析对样本制备方法高度敏感，需要在数据解读时格外谨慎。

整合原生质体与核数据进行综合分析，可能是构建最全面、最准确的植物细胞图谱的未来方向。

随着单细胞技术向更多非模式植物物种拓展，本研究提供的优化方案和数据质量评估无疑将成为科研人员在选择实验策略时的重要参考。当我们面对植物体内那些难以触及的细胞类型时，一管高质量分离的细胞核，或许就是打开新世界大门的那把钥匙。而这一切的起点，正是一次精心设计、严格质控的核分离实验。

参考文献：
Wang J, Zheng S, Lu B, et al. Integrated experimental and computational workflows for single-cell transcriptomics in plants. Plant Methods. 2026;22(1):12. Published 2026 Jan 3. doi:10.1186/s13007-025-01490-6

本产品适用于新鲜植物样本的细胞核分离。通过裂解细胞膜，释放细胞核的同时保持细胞核膜的稳定，经密度梯度离心快速地从植物样本中分离纯化细胞核，并减少碎片及次生代谢产物的残留。