2026年3月，一项发表于《自然通讯》（Nature Communications）的研究，为解决超分辨率荧光成像中长期存在的技术瓶颈提供了一个全新的通用型蛋白标记系统。这项研究开发了名为FLEXTAG（Fluorescent Labeling for Exchangeable, X-resilient Tagging in Advanced Generic Nanoscopy）的框架，其核心是三个彼此正交、尺寸超小（12-18 kDa）且具有“自我更新”能力的蛋白标签。该系统通过有机荧光染料的持续交换，显著缓解了光漂白问题，并兼容包括SIM（结构光照明显微镜）、STED（受激发射损耗显微镜）、STORM（随机光学重建显微镜）和PAINT（点积累成像纳米拓扑术）在内的主流超分辨成像模式。尤为重要的是，研究团队还创新性地开发了“保护性固定”方法与化学封闭策略，有效克服了化学固定导致的标记效率下降和非特异性荧光背景问题，实现了在活细胞和固定细胞中均能进行高质量、抗光漂白的多色超分辨成像。

这项重要工作的主要完成者包括Han Zhang, Yuan Yao, Xuye Wang, Yuanmin Zheng, Shaoqing Zhang, Yuan Tao, Haopeng Yang, Yinqi Wang, Mengde Liu, Marina Feric 和 Ruobo Zhou。他们共同完成的论文《FLEXTAG: a small and self-renewable protein labeling system for anti-fading multi-color super-resolution imaging》于2026年3月在线发表。

重要发现
本研究系统性地开发并验证了FLEXTAG蛋白标记系统，旨在克服当前超分辨成像中蛋白标签技术的四大主要局限：快速光漂白、标签诱导的蛋白错误定位与聚集假象、固定后标记效率低下以及有限的多色复用能力。FLEXTAG通过整合三个精心工程化改造的小尺寸自我更新标签、一套保护性固定方案以及优化的封闭策略，为长时程、多色、纳米精度的细胞成像提供了一个“一站式”解决方案。

FLEXTAG1的开发：其前体来源于人源蛋白BRD4的第二溴结构域（BRD4BD2）的一个突变体（L55A），原本用于靶向蛋白降解。研究首先证实其配体ET-JQ1在成像条件下对细胞内源性溴结构域蛋白的结合可忽略不计。随后，为克服该蛋白强烈的二聚化倾向导致的标记蛋白聚集问题，团队利用ColabFold人工智能工具预测其二聚界面，并引入关键点突变（H105A, M120G）以破坏二聚化。最终获得的突变体BRD4BD2L55A, H105A, M120G在保持高标记效率的同时，极大地减少了聚集，被确立为FLEXTAG1。即使在后续保护性固定所需的高浓度配体存在下，也未诱发显著聚集。

FLEXTAG2的开发：以前人大肠杆菌二氢叶酸还原酶（eDHFR）的非共价标签系统为基础。为提高其相对较低的标记效率，研究者假设eDHFR固有的结构不稳定性是原因之一。他们通过引入能够形成分子内二硫键的突变（P89C）并在N端添加一段多甘氨酸连接子（C(G)5），设计出了C(G)5-eDHFRP89C变体。该变体通过稳定蛋白构象，将标记效率提升了约3.3倍，同时保持了单体状态和快速配体交换动力学，非常适合PAINT成像，因此被命名为FLEXTAG2。

FLEXTAG3的开发：基于人源FKBP蛋白的F36V突变体。尽管其配体SLF’结合亲和力极高，但交换动力学过慢，不利于自我更新。为此，团队筛选了配体结合口袋附近的一系列单点突变，发现I91A突变（FKBPF36V, I91A）能在维持足够标记亮度的同时，显著加快配体交换速率，从而使其兼容PAINT成像。该变体被确定为FLEXTAG3。虽然其仍存在约20%的轻微二聚化倾向，但处于可接受范围。

保护性固定方法：为解决标记效率下降，团队提出了“保护性固定”策略。在固定前，用高浓度、无荧光的FLEXTAG配体（如ET-JQ1、TMP、SLF’）预处理活细胞，使其预先占据标签的结合口袋。随后，在固定液中也包含这些配体的情况下进行固定。这种方法能有效“锁住”标签的配体结合构象，屏蔽交联反应，从而在固定后大幅保留标签的可及性。实验表明，此方法能将固定后标签的标记效率恢复至活细胞水平的49.7%到72.2%，较传统固定有3.1到8.8倍的提升。

兼容SMLM技术（PAINT, STORM）：FLEXTAG配体与标签的动态、可逆结合本质上是PAINT成像的理想机制。研究展示了所有三个FLEXTAG标签在2D和3D PAINT成像中的优异表现，并实现了与phalloidin-PAINT探针结合的三色成像。在更具挑战的活细胞STORM成像中，团队将FLEXTAG3与光开关染料HMSiR结合。在长达4.5分钟的连续成像中，FLEXTAG3保持了96.6%的单分子定位点，而对照的非更新型HaloTag信号衰减超过70%。这证明了FLEXTAG-STORM能够支持对线粒体动力学等过程的长时间、高分辨率活细胞观测。

FLEXTAG是一个集小型化、最小聚集性、自我更新能力和高度正交性于一体的综合性蛋白标记框架。它成功克服了现有标签系统在光稳定性、标记准确性、固定细胞兼容性和多色能力方面的关键限制，为在活细胞和固定细胞中进行长期、多色、纳米精度的超分辨率成像研究提供了一个强大而通用的工具。

创新与亮点
本研究最主要的创新在于系统性地攻克了超分辨成像蛋白标记领域的多个长期痛点。首先，它创造了目前性能最均衡的自我更新蛋白标签：相比已有的dHaloTag，FLEXTAG尺寸小一半（<20 kDa），更少引起蛋白错误定位；相比基于荧光蛋白发色团的pFAST等标签，FLEXTAG兼容更亮、更多样化的有机染料，光稳定性和亮度显著提升。其次，它创新性地提出了“保护性固定”方案，首次有效解决了自我更新标签在固定细胞中标记效率骤降的难题，将此技术的应用范围从活细胞拓展至固定样本，为连接动态成像与超微结构分析（如关联光镜电镜）铺平了道路。第三，它展现了真正的“一标多用”通用性，同一套FLEXTAG标记的样本，可根据分辨率、速度等不同需求，无缝切换至SIM、STED、PAINT或STORM等不同原理的超分辨显微镜进行成像，极大提升了实验灵活性。

总结与展望
总而言之，FLEXTAG通过集成三个小型化、自更新的正交蛋白标签，辅以创新的样品制备方法，构建了一个强大而通用的超分辨成像标记框架，显著推进了纳米尺度生命过程可视化能力。展望未来，该系统的应用潜力巨大。一方面，可进一步探索其在关联光镜-电镜（CLEM）中的价值，将FLEXTAG揭示的蛋白动态信息与电镜提供的超微结构上下文精准整合。另一方面，其小型化和高保真的特性使其非常适合用于标记内源基因位点，结合CRISPR等技术，有望在更接近生理的条件下研究内源蛋白的行为。此外，继续开发光谱范围更广、亮度更高、交换动力学更优的新型配体-染料组合，将进一步提升FLEXTAG在深度多色成像和高速动态观测中的性能边界。

DOI:10.1038/s41467-026-69658-9.