肝细胞癌（HCC）作为全球高发的恶性肿瘤，尽管免疫检查点抑制剂等治疗策略已部分改善了患者的临床预后，但总体客观响应率仍受限于肿瘤异质性。新抗原（neoantigens）作为肿瘤细胞基因组变异或异常翻译所特有的“免疫身份标签”，是激活特异性细胞毒性T细胞、实现精准免疫清除的关键。然而，传统基于基因组与转录组测序结合生物信息学预测的新抗原发现多局限于经典编码区突变，忽略了非编码区及转座元件的“隐蔽抗原”，导致潜在的高免疫原性靶点被忽略。

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研究成果展示      

▶ 发表时间：2026年

▶ 期刊：Journal of Hepatology Report (IF 7.5)

▶ 文章标题：

Mass Spectrometry-Based De Novo Sequencing Reveals Non-CanonicalNeoantigens with Anti-Tumor Efficacy inHepatocellular Carcinoma

▶ 核心内容：

近日，福建医科大学孟超肝胆医院刘小龙团队与加拿大滑铁卢大学李明院士（百蓁生物创始人）团队合作，利用基于从头测序的免疫肽组学质谱技术，结合深度学习免疫原性评分与体内功能验证，成功从肝癌中筛选出具有强效抗肿瘤效应的非经典新抗原，为个性化肝癌免疫治疗提供了关键证据。研究成果发表于国际知名期刊《Journal of Hepatology Report》。百蓁生物参与完成了该项研究的新抗原发现以及抗原肽体内靶向验证等工作。

01 质谱领航：超越算法预测瓶颈，精准捕获真实“暗抗原”

这项研究充分展示了基于质谱（MS）的从头测序技术在新抗原发现中的突破性优势。与传统依赖基因组数据库和算法预测的方法相比，该技术通过直接检测肿瘤细胞表面真实呈递的肽段，实现了两大核心超越：一是能够发现传统预测难以捕获的、源自非编码区、转座子及长链非编码RNA等的“非经典抗原”，大幅拓展了肿瘤抗原谱；二是确保所鉴定的抗原为真实呈递的免疫靶点，有效规避了算法预测的假阳性问题，免疫原性更为可靠。研究不仅完成了从抗原发现到功能验证的全流程，还成功验证了基于这些新抗原的肽疫苗策略，为肝癌个性化免疫治疗建立了可重复性的有效技术路径。

研究设计概览：研究人员在C57BL/6小鼠皮下接种Hepa1-6肝癌细胞，建立皮下瘤模型。通过MHC-I免疫沉淀富集免疫肽，结合高分辨率质谱进行数据采集，使用PEAKS^® Online软件进行免疫肽组分析。经典肽段（PCs）包含 4663 条匹配经典蛋白的肽段 + 154 条单氨基酸变异体（SAAVs），共 4817 条；非经典肽段（PNCs）为 759 条无法匹配经典参考序列的从头测序解析肽段。随后通过深度学习模型DeepImmun^®预测免疫原性、ELISpot验证T细胞反应、PRM靶向质谱确认其内源表达，并将高免疫原性肽段制备成多肽疫苗，并结合poly(I:C)佐剂在皮下和原位肝癌模型中评估抗肿瘤效果。

图1 研究流程

02 重磅发现：非经典肽来源多样，具备MHC递呈能力

研究共鉴定出5576条高可信免疫肽，其中4663条匹配经典数据库，759条被归类为非经典肽。超过48%的肽段在IEDB数据库中有记录，肽长度分布集中在8-10氨基酸，符合MHC-I经典特征。约56%的洗脱肽段被预测为MHC结合肽，其中超过73%的MHC结合肽特异性结合H2-Kb，且多数为强结合（SB），具备成为新抗原的潜力。在鉴定出的759条非经典肽段（PNCs）中，其基因组来源呈现显著的多样性：59条源自内含子区，43条源自转座子元件，25条源自转座子内部的开放阅读框（rmsk_ORFs），另有1条源自长链非编码RNA。基序分析结果显示，非经典肽与经典肽具有相同的MHC结合基序，说明非经典肽同样能被MHC正常递呈。

图2 免疫肽组整体特征

03 不止经典：深度学习助力发现更强免疫原性的非经典抗原肽

研究团队设定了严格的筛选标准：肿瘤特异性表达、8-10个氨基酸长度、预测强MHC结合亲和力、高免疫原性评分，最终选出7条经典肽和13条非经典肽。经深度学习预测的高免疫原性肽段，有95%通过ELISpot实验验证为阳性，可诱导出显著的IFN-γ分泌。经典肽的T细胞激活能力显著高于野生肽，而非经典肽的免疫原性甚至超过经典肽，提示非经典来源肽段的基因组来源特殊，不会在胸腺选择过程中被呈递，最终形成了更具有反应性的T细胞库。

图3 新抗原筛选与免疫原性验证

04 疫苗疗效：非经典肽长肽疫苗强力抑制肿瘤生长

基于ELISpot结果，研究人员将7条免疫原性最强的经典肽和7条非经典肽分别制备成短肽（8-10aa）和长肽（17-25aa）疫苗，并联合poly(I:C)分别在皮下和原位肝癌模型中评估疗效。同时纳入传统NGS预测的突变肽作为对照。

在皮下瘤模型中，所有疫苗组均显著抑制肿瘤生长。非经典短肽组效果尤为突出：40%的短肽组小鼠肿瘤在第14天完全消除，但部分小鼠在14天后出现复发，提示短肽可能诱导免疫耐受。长肽组则表现出持续抑制，肿瘤负荷远低于短肽组，且显著优于NGS来源的突变肽组，证实长肽能避免耐受，诱导持久免疫记忆。免疫分析显示，疫苗组DC成熟度、效应记忆T细胞、中央记忆T细胞及CD8⁺ T细胞活化标志均显著升高，其中非经典长肽组CD8⁺ T细胞活化最强。

图4 皮下模型抗肿瘤疗效

在原位肝癌模型中，所有疫苗组均显著抑制肿瘤生长，经典长肽和非经典长肽组抑制肿瘤效果最强，且诱导的效应记忆T细胞（TEM）显著高于其他组，同时CD8⁺T细胞浸润显著超过NGS来源肽段组。与皮下模型结果高度一致。

图5 原位模型抗肿瘤疗效

05 靶向验证：确认候选肽在肿瘤中真实存在

为证实这些新抗原确实在肿瘤内源表达，研究者采用平行反应监测（PRM）靶向质谱对皮下和原位肿瘤样本进行验证。部分短肽在皮下瘤和原位瘤中检出，延伸的长肽中也有部分在两种肿瘤中均被检测到。

本研究首次在肝癌疫苗研究中构建了“质谱免疫肽组学→深度学习筛选→体外免疫验证→PRM内源确认→体内疫苗评价”的全链条非经典新抗原发现与验证体系，取得了以下关键突破：

1. 系统性揭示非经典新抗原：首次在肝癌小鼠模型中大规模鉴定到759条非经典免疫肽，来源覆盖内含子、转座元件等非编码区域，拓展了新抗原库。

2. 高效免疫原性验证：深度学习预测准确率高达95%，且非经典肽的免疫原性显著强于经典肽，为优选强效靶点提供了新思路。

3. 疫苗疗效超越传统NGS法：基于质谱来源肽制备的长肽疫苗，在皮下和原位模型中均表现出优于NGS来源肽的肿瘤抑制效果，且长肽能有效克服短肽诱导的免疫耐受。

4. 内源表达确认：PRM验证了候选肽在肿瘤组织中的真实存在，确保了发现的可靠性。