NSUN2介导的m5C修饰BHLF1 RNA促进EB病毒的裂解复制
2026-07-22 来源:本站 点击次数:672026年6月18日，中山大学肿瘤防治中心陈明远教授团队在《Cell Reports》期刊发表题为“NSUN2-mediated m5C modification of BHLF1 RNA facilitates the lytic replication of Epstein-Barr virus”的科研成果。研究系统揭示了RNA 5-甲基胞嘧啶（m5C）修饰在调控Epstein-Barr病毒（EBV）裂解复制中的关键调控机制。
英文标题：NSUN2-mediated m5C modification of BHLF1 RNA facilitates the lytic replication of Epstein-Barr virus
译文标题：NSUN2介导的m5C修饰BHLF1 RNA促进EB病毒的裂解复制
发表时间：2026年6月18日
发表期刊：Cell Reports
影响因子：IF7.7/Q1
技术平台：RNA-BS、WGBS
作者单位：中山大学肿瘤防治中心、中山大学附属第五医院
DOI:10.1016/j.celrep.2026.117562
发表时间：2026年6月18日
发表期刊：Cell Reports
影响因子：IF7.7/Q1
技术平台：RNA-BS、WGBS
作者单位：中山大学肿瘤防治中心、中山大学附属第五医院
DOI:10.1016/j.celrep.2026.117562
研究团队发现，在EBV阳性鼻咽癌（NPC）细胞、患者来源异种移植瘤（PDX）组织以及急性EBV感染的鼻咽上皮细胞中，EBV基因BHLF1的转录本在核苷酸173位点存在高度富集的特异性m5C修饰。通过RNA亚硫酸盐测序（RNA-BS）技术精确定位修饰位点后，研究进一步鉴定出NSUN2是催化该修饰的“writers”酶。机制研究表明，NSUN2介导的m5C修饰不仅增强了BHLF1 RNA的稳定性，还通过NSUN2与DNA甲基转移酶1（DNMT1）互作，将DNMT1招募至EBV裂解复制起点（oriLyt）区域，促进局部DNA甲基化，从而增强裂解开关蛋白BZLF1的结合，最终促进EBV高效裂解复制。该研究阐明RNA m5C修饰与DNA甲基化在EBV生命周期中的协同调控机制，为理解EBV相关恶性肿瘤发病机制和开发相关疗法提供新的表观遗传学视角。
研究亮点
研究亮点
-
EBV BHLF1 RNA受NSUN2介导发生m5C修饰
-
NSUN2增强BHLF1 RNA的稳定性
-
NSUN2通过招募DNMT1调控DNA甲基化
-
RNA m5C修饰促进EBV裂解复制
研究摘要
研究方法
（1）细胞模型与样本
使用EBV阳性的鼻咽癌细胞系（TW03EBV、HNE1EBV）、急性EBV感染的NPEC2-Bmi1细胞、患者来源的异种移植瘤组织以及原代NPC细胞。
（2）分子机制探索
RNA亚硫酸盐测序（RNA-BS）：全转录组水平或reads中173位点基因特异性水平定位和定量检测m5C修饰。
全基因组亚硫酸盐测序（WGBS）：评估整体DNA甲基化水平。
（3）下游机制验证
MeDIP-qPCR：定量EBV oriLyt区域DNA甲基化水平
ChIP-qPCR：检测DNMT1和BZLF1在oriLyt区域的结合富集情况。
RIP：验证NSUN2蛋白与BHLF1 RNA的直接结合。
（4）功能实验
CRISPR-Cas9基因敲除和siRNA沉默：分别用于敲除NSUN2和敲低DNMT1等关键基因。
RNA稳定性实验：利用放线菌素D阻断转录后，通过qPCR监测mRNA的降解速率，计算半衰期。
病毒拷贝数检测：qPCR定量EBV基因组DNA，评估病毒复制效率。
RNA荧光原位杂交：观察BHLF1 RNA形成的病毒诱导结节结构。
共免疫沉淀（co-IP）：验证NSUN2与DNMT1的相互作用
免疫荧光共定位：检测NSUN2与DNMT1在细胞核内的共定位。
结果图形
使用EBV阳性的鼻咽癌细胞系（TW03EBV、HNE1EBV）、急性EBV感染的NPEC2-Bmi1细胞、患者来源的异种移植瘤组织以及原代NPC细胞。
（2）分子机制探索
RNA亚硫酸盐测序（RNA-BS）：全转录组水平或reads中173位点基因特异性水平定位和定量检测m5C修饰。
全基因组亚硫酸盐测序（WGBS）：评估整体DNA甲基化水平。
（3）下游机制验证
MeDIP-qPCR：定量EBV oriLyt区域DNA甲基化水平
ChIP-qPCR：检测DNMT1和BZLF1在oriLyt区域的结合富集情况。
RIP：验证NSUN2蛋白与BHLF1 RNA的直接结合。
（4）功能实验
CRISPR-Cas9基因敲除和siRNA沉默：分别用于敲除NSUN2和敲低DNMT1等关键基因。
RNA稳定性实验：利用放线菌素D阻断转录后，通过qPCR监测mRNA的降解速率，计算半衰期。
病毒拷贝数检测：qPCR定量EBV基因组DNA，评估病毒复制效率。
RNA荧光原位杂交：观察BHLF1 RNA形成的病毒诱导结节结构。
共免疫沉淀（co-IP）：验证NSUN2与DNMT1的相互作用
免疫荧光共定位：检测NSUN2与DNMT1在细胞核内的共定位。
结果图形
（1）EBV BHLF1 RNA存在m5C修饰
为探究EBV转录组中是否存在m5C修饰位点，研究团队首先对处于不同EBV生命周期阶段的多种细胞（包括潜伏期和裂解期、急性感染的NPC细胞）以及一个PDX样本提取的poly(A) RNA进行了RNA亚硫酸盐测序（RNA-BS）。结果显示，在EBV基因中共鉴定出10个m5C位点。其中，BHLF1 RNA的第173位胞嘧啶（对应EBV基因组反义链的40357位） 在多个经历急性EBV感染或裂解诱导的NPC细胞样本以及PDX组织中均被反复检测到（图1A-B）。这一结果通过基因特异性RNA-BS得到了进一步验证。此外，对宿主细胞mRNA的m5C分布分析显示，m5C位点主要富集于编码序列（CDS，46.98%）和3'非翻译区（3'UTR，32.7%），与既往报道一致（图1C-D）。RNA-BS技术为精确定位EBV转录本上的单碱基分辨率m5C修饰提供关键技术支持，是发现BHLF1 RNA m5C修饰的核心技术基础。
图1：m5C修饰在EBV转录本和宿主mRNA上的分布
（2）NSUN2介导BHLF1转录本的m5C修饰
在确定BHLF1存在m5C修饰后，研究团队开始寻找催化m5C修饰的writers酶，通过敲低已知m5C writers酶（包括NSUN家族成员和TRDMT1），然后再次通过基因特异性RNA-BS测序来检测BHLF1 RNA第173位点的m5C水平。结果显示，只有敲低NSUN2能显著降低m5C水平，而其他writers敲低影响不大（图2A）。RNA免疫共沉淀实验证实NSUN2蛋白能够特异性地富集BHLF1 RNA（图2D-2F）。此外，将含有m5C位点的BHLF1 RNA片段克隆后，发现野生型NSUN2可以显著免疫沉淀野生型序列，而对该位点进行C→G突变后，结合能力则显著下降（图2H）。上述实验证明NSUN2通过其催化活性直接介导BHLF1 RNA 173位点的m5C修饰，基因特异性RNA-BS技术在此过程中发挥定量验证修饰水平的核心作用。
在确定BHLF1存在m5C修饰后，研究团队开始寻找催化m5C修饰的writers酶，通过敲低已知m5C writers酶（包括NSUN家族成员和TRDMT1），然后再次通过基因特异性RNA-BS测序来检测BHLF1 RNA第173位点的m5C水平。结果显示，只有敲低NSUN2能显著降低m5C水平，而其他writers敲低影响不大（图2A）。RNA免疫共沉淀实验证实NSUN2蛋白能够特异性地富集BHLF1 RNA（图2D-2F）。此外，将含有m5C位点的BHLF1 RNA片段克隆后，发现野生型NSUN2可以显著免疫沉淀野生型序列，而对该位点进行C→G突变后，结合能力则显著下降（图2H）。上述实验证明NSUN2通过其催化活性直接介导BHLF1 RNA 173位点的m5C修饰，基因特异性RNA-BS技术在此过程中发挥定量验证修饰水平的核心作用。
图2 ：NSUN2介导BHLF1 RNA的m5C修饰
（3）NSUN2增加BHLF1 RNA的稳定性
为验证m5C修饰对病毒生物学功能的影响，研究团队首先发现敲除NSUN2显著抑制EBV的裂解复制（EBV基因组拷贝数降低）（图3A）和关键裂解蛋白BZLF1的表达（图3B）。进一步分析发现，NSUN2敲除导致BHLF1 RNA水平显著下降（图3C）。在放线菌素D处理实验中，NSUN2敲除细胞中BHLF1 RNA的降解速度比对照细胞更快，半衰期更短，表明m5C修饰直接增强BHLF1 RNA稳定性（图3F）。而回补野生型NSUN2能恢复稳定，催化失活的突变体则不能。此外，BHLF1 RNA已被报道在EBV裂解复制中具有重要作用，能够形成“病毒诱导结节结构”。RNA-ISH实验显示，NSUN2敲除后，形成这种结节结构的细胞比例显著减少（图3D-E）。最后，通过敲低BHLF1 RNA，证实它能促进EBV复制，并且是NSUN2促进复制的下游效应分子（图3G）。综上，NSUN2介导的m5C修饰通过增强BHLF1 RNA的稳定性，促进VINORCs形成，最终驱动EBV高效裂解复制（图3H）。
为验证m5C修饰对病毒生物学功能的影响，研究团队首先发现敲除NSUN2显著抑制EBV的裂解复制（EBV基因组拷贝数降低）（图3A）和关键裂解蛋白BZLF1的表达（图3B）。进一步分析发现，NSUN2敲除导致BHLF1 RNA水平显著下降（图3C）。在放线菌素D处理实验中，NSUN2敲除细胞中BHLF1 RNA的降解速度比对照细胞更快，半衰期更短，表明m5C修饰直接增强BHLF1 RNA稳定性（图3F）。而回补野生型NSUN2能恢复稳定，催化失活的突变体则不能。此外，BHLF1 RNA已被报道在EBV裂解复制中具有重要作用，能够形成“病毒诱导结节结构”。RNA-ISH实验显示，NSUN2敲除后，形成这种结节结构的细胞比例显著减少（图3D-E）。最后，通过敲低BHLF1 RNA，证实它能促进EBV复制，并且是NSUN2促进复制的下游效应分子（图3G）。综上，NSUN2介导的m5C修饰通过增强BHLF1 RNA的稳定性，促进VINORCs形成，最终驱动EBV高效裂解复制（图3H）。
图3：m5C writers酶NSUN2提升BHLF1 RNA稳定性，促进EBV裂解复制
（4）NSUN2调控DNA甲基化并与DNMT1结合
已知RNA和DNA甲基化之间存在调控关系。为探究m5C修饰是否能影响DNA甲基化，研究团队对敲除NSUN2和对照细胞进行了全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）。分析结果显示，NSUN2敲除导致对应RNA m5C位点附近基因组DNA甲基化水平显著下降（图4A）。进一步通过内源性NSUN2免疫沉淀实验发现，NSUN2蛋白能够特异性地与DNA甲基转移酶DNMT1发生物理互作，而与DNMT3A和DNMT3B没有互作（图4B）。该互作在DNMT1的免疫沉淀实验中得到反向验证（图4C）。随后的免疫荧光共定位实验显示，NSUN2与DNMT1在细胞核中共定位（图4E）。这些结果表明，NSUN2可能通过招募DNMT1到特定的基因组位点以调控对应基因组区域的DNA甲基化。
已知RNA和DNA甲基化之间存在调控关系。为探究m5C修饰是否能影响DNA甲基化，研究团队对敲除NSUN2和对照细胞进行了全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）。分析结果显示，NSUN2敲除导致对应RNA m5C位点附近基因组DNA甲基化水平显著下降（图4A）。进一步通过内源性NSUN2免疫沉淀实验发现，NSUN2蛋白能够特异性地与DNA甲基转移酶DNMT1发生物理互作，而与DNMT3A和DNMT3B没有互作（图4B）。该互作在DNMT1的免疫沉淀实验中得到反向验证（图4C）。随后的免疫荧光共定位实验显示，NSUN2与DNMT1在细胞核中共定位（图4E）。这些结果表明，NSUN2可能通过招募DNMT1到特定的基因组位点以调控对应基因组区域的DNA甲基化。
图4：NSUN2通过招募DNMT1促进DNA甲基化
（5）NSUN2招募DNMT1以促进EBV oriLyt区域的DNA甲基化
为验证上述机制在EBV基因组中的功能相关性，研究团队靶向紧邻BHLF1 RNA m5C位点对应基因组序列的EBV裂解复制起点oriLyt区域（图5A）。MeDIP-qPCR实验表明，NSUN2敲除显著降低oriLyt区域靠近BHLF1 RNA m5C位点一侧的DNA甲基化水平，而回补野生型NSUN2能恢复这一甲基化，但催化失活突变体不能（图5B）。ChIP-qPCR实验进一步证实，NSUN2敲除减少DNMT1在这段oriLyt区域的结合（图5C）。
功能实验表明，DNMT1敲低显著抑制EBV裂解复制（图5D-E），而过表达DNMT1则促进裂解复制。已知裂解开关蛋白BZLF1（又称Zta）是oriLyt结合蛋白，优先结合甲基化的病毒DNA以启动裂解复制。ChIP-qPCR结果显示，NSUN2敲除显著降低BZLF1在oriLyt区域的结合（图5F），而DNMT1过表达则增强BZLF1招募。基于上述发现，研究团队提出一个工作模型：NSUN2介导BHLF1 RNA的m5C修饰，通过BHLF1 RNA将DNMT1招募至oriLyt区域，促进局部DNA甲基化，从而增强BZLF1的结合和转录激活功能，最终促进EBV的高效裂解复制（图5G）。
为验证上述机制在EBV基因组中的功能相关性，研究团队靶向紧邻BHLF1 RNA m5C位点对应基因组序列的EBV裂解复制起点oriLyt区域（图5A）。MeDIP-qPCR实验表明，NSUN2敲除显著降低oriLyt区域靠近BHLF1 RNA m5C位点一侧的DNA甲基化水平，而回补野生型NSUN2能恢复这一甲基化，但催化失活突变体不能（图5B）。ChIP-qPCR实验进一步证实，NSUN2敲除减少DNMT1在这段oriLyt区域的结合（图5C）。
功能实验表明，DNMT1敲低显著抑制EBV裂解复制（图5D-E），而过表达DNMT1则促进裂解复制。已知裂解开关蛋白BZLF1（又称Zta）是oriLyt结合蛋白，优先结合甲基化的病毒DNA以启动裂解复制。ChIP-qPCR结果显示，NSUN2敲除显著降低BZLF1在oriLyt区域的结合（图5F），而DNMT1过表达则增强BZLF1招募。基于上述发现，研究团队提出一个工作模型：NSUN2介导BHLF1 RNA的m5C修饰，通过BHLF1 RNA将DNMT1招募至oriLyt区域，促进局部DNA甲基化，从而增强BZLF1的结合和转录激活功能，最终促进EBV的高效裂解复制（图5G）。
图5：NSUN2促进EBV oriLyt区域DNMT1介导的DNA甲基化
结论和启示
本研究通过RNA-BS和WGBS等表观组学测序技术鉴定出EBV BHLF1 RNA上的m5C修饰位点（核苷酸173），证明NSUN2是该修饰的关键催化酶。NSUN2通过双重机制促进EBV裂解复制：一方面，m5C修饰增强BHLF1 RNA稳定性，促进VINORCs形成；另一方面，NSUN2通过BHLF1 RNA招募DNMT1至oriLyt区域，促进局部DNA甲基化，增强BZLF1结合，从而协同驱动EBV的高效裂解复制。
RNA-BS在本研究中的重要作用
RNA-BS在本研究中的重要作用
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发现新m5C修饰位点：RNA-BS以单碱基分辨率鉴定EBV BHLF1 RNA上核苷酸173位点的m5C修饰，该位点在多种EBV感染模型（细胞系、PDX组织、急性感染细胞）中均稳定存在，表明其具有重要的生物学功能。
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甲基转移酶筛选验证：在NSUN2功能验证中，基因特异性RNA-BS定量评估BHLF1 m5C水平。精确锁定NSUN2这一关键“writers”酶。
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突变体验证的可靠性：在验证NSUN2与BHLF1 RNA相互作用的特异性时，RNA-BS的定量结果（C173G突变体m5C水平显著降低）为RIP实验提供了独立的生化证据，增强结论可信度。
参考文献：
Xia TL, Tan LQ, Zhang A, Chen K, Liu YP, You R, Chen MY. NSUN2-mediated m5C modification of BHLF1 RNA facilitates the lytic replication of Epstein-Barr virus. Cell Rep. 2026 Jun 18;45(7):117562. doi: 10.1016/j.celrep.2026.117562.
Xia TL, Tan LQ, Zhang A, Chen K, Liu YP, You R, Chen MY. NSUN2-mediated m5C modification of BHLF1 RNA facilitates the lytic replication of Epstein-Barr virus. Cell Rep. 2026 Jun 18;45(7):117562. doi: 10.1016/j.celrep.2026.117562.
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