钙化性主动脉瓣疾病（CAVD）是全球范围内常见的人类瓣膜疾病，目前缺乏有效的药理学方法。核受体亚家族4A组成员1(NR4A1)与多种心血管疾病的发病机制密切相关，已成为诊断和治疗多种疾病的关键靶点。然而，NR4A1在CAVD发病中的具体分子机制和功能意义尚未全面阐明。华中科技大学同济医学院附属协和医院（武汉协和医院）董念国、史嘉玮研究团队在International Journal of Biological Sciences (IF 10)上发表文章“Orphan Nuclear Receptor NR4A1 Promotes Proliferation and Osteogenic Differentiation of Valvular Interstitial Cells through Activation of CCND2”，证明NR4A1显著促进细胞增殖并强化VIC的成骨分化过程，提出靶向NR4A1可能是CAVD的潜在治疗策略。

· 维真生物助力 - 腺病毒·

基因信息：NR4A1，核受体亚家族4A组成员1

腺病毒产品：Ad-NR4A1

实验细胞：原代瓣膜间质细胞（VICs）

MOI：70

结果展示

1. NR4A1促进VICs的成骨分化

作者发现人钙化主动脉瓣(CAV)中NR4A1显著上调，因此探讨了NR4A1对VICs的成骨分化的影响。发现NR4A1表达在成骨诱导过程中增加，同时成骨标记物RUNX2和ALP上调，表明其参与原代瓣膜间质细胞（VICs）分化。作者通过siNR4A1或腺病毒（Ad-NR4A1）以沉默或过表达NR4A1。蛋白质印迹分析显示，沉默NR4A1会降低ALP和RUNX2的表达，而过表达会增强其水平。同样沉默NR4A1后，ALP和钙盐沉积的活性显著降低，而过表达导致相反的结果。此外，通过NR4A1激动剂Csn-B和抑制剂DIM-C干预，发现NR4A1的激活促进VIC增殖并加剧主动脉瓣钙化。

图1 NR4A1促进VIC成骨分化

2. NR4A1通过上调CCND2促进VIC增殖和钙化

作者通过转录组分析筛选了成骨分化至关重要的NR4A1候选靶基因，发现NR4A1可能通过调控CCND2来调节VIC的细胞周期，并证实了CCND2在瓣膜钙化过程中发挥重要功能。然后作者进行了挽救实验，以确定NR4A1是否通过上调CCND2来发挥其作用。免疫印迹显示CCND2敲除有效减弱NR4A1诱导的RUNX2和ALP上调。此外，CCND2缺失抑制了NR4A1过表达引发的细胞增殖。CCND2敲除降低了ALP活性和钙沉积，相反，CCND2的过表达逆转了NR4A1敲低诱导的钙化效应。这些结果表明NR4A1通过上调人VIC中的CCND2促进细胞增殖并加速细胞成骨转化。

图2 CCND2沉默可减轻NR4A1诱导的成骨分化表型

3. 抑制NR4A1可减轻体内主动脉瓣钙化

作者进一步在体内探究NR4A1抑制对主动脉瓣钙化的影响。ApoE−/−小鼠均接受24周的高脂肪饮食，其中一组接受DIM-C（NR4A1抑制剂）治疗，另一组不接受DIM-C。超声心动图评估显示，与未经DIM-C治疗组相比，DIM-C治疗组中的小鼠表现出最大跨瓣膜射流速度和平均跨瓣膜压力梯度显著降低。此外DIM-C治疗引起ApoE−/−小鼠主动脉瓣增厚显著减弱，主动脉瓣叶内的钙沉积明显减少，胶原蛋白形成减少。成骨标志物RUNX2的免疫荧光染色显示，DIM-C治疗组中RUNX2表达显著下调。作者进一步评估了DIM-C的潜在副作用，发现DIM-C治疗组与对照组之间与肝肾功能相关的生化参数没有显著差异。HE染色显示DIM-C对心脏、肝脏、脾脏、肺或肾脏没有显著影响，这些体内结果强调，抑制NR4A1可以有效减轻主动脉瓣钙化。

图3 体内抑制NR4A1可减轻主动脉瓣钙化

实验结论

本研究研究揭示了CAVD中NR4A1的显著上调，证明NR4A1通过上调细胞周期相关蛋白CCND2的表达在VIC的增殖和细胞外基质合成中发挥关键作用，表明靶向NR4A1或CCND2可能成为治疗CAVD的创新方法。