RNA 干扰（RNAi）是研究基因功能缺失的核心技术。该技术通过导入同源双链 RNA，诱导靶 mRNA 降解，可在细胞内高效、特异性地抑制特定基因表达。siRNA 与 shRNA 均为常用的基因沉默工具：siRNA 作用时效较短，多用于短期实验；而 shRNA 依托载体系统表达，更适合实现长期稳定的基因沉默。本期内容，我们将重点讲解 shRNA 的构建策略。

传统shRNA策略通常针对一个基因设计1条shRNA，常存在敲低效率不稳定、脱靶效应、基因补偿机制等问题，易导致实验结果偏差，影响结论可靠性。多靶点shRNA克隆则是在单一表达载体上串联2~4条高效shRNA序列，可同时靶向同一基因多位点或多个不同基因，实现一次转染、多重沉默。

一、多靶点shRNA克隆构建策略

1：多启动子独立驱动

在单一载体中整合多个不同的Pol Ⅲ启动子，分别转录各自的shRNA结构单元。每条shRNA由独立的启动子控制转录，从设计上有效避免了意外重组，且每条shRNA的转录不受其他shRNA干扰。

2：microRNA簇结构驱动

基于内源性microRNA簇结构，将多个shRNA按优化间距嵌入microRNA支架并串联在单一Pol Ⅱ启动子下游，通过细胞自身的microRNA加工通路同步生成多条功能性shRNA，实现高效、稳定的多基因沉默。

优势：

1）将多个作用于同一基因不同mRNA部位的shRNA序列克隆进同一shRNA载体，增加目的基因下调表达的概率。

2）将高效地、作用于2-4个靶基因的shRNA序列克隆进同一shRNA载体，实现2-4个基因同时下调表达的目的。

3）无需序列筛选，大大减少实验工作量。

二、维真生物多靶点shRNA特色服务

维真生物拥有十余年 shRNA 载体构建与病毒包装经验，可自主设计、筛选高效 shRNA序列。依托成熟的多靶点shRNA克隆技术，我们可为您搭建 2in1、3in1、4in1 多合一 shRNA 质粒载体。

以4 in 1 shRNA为例：该服务是将4条shRNA序列克隆至同一个shRNA载体上，不仅可以作为质粒直接转染细胞，也可包装为病毒感染宿主，我们有腺病毒穿梭载体、慢病毒载体和腺相关病毒载体，各类病毒载体供选择，满足您多样化实验需求。

三、维真生物多靶点shRNA克隆技术应用案例

1、质粒案例

文章题目：KIF23 Promotes Gastric Cancer by Stimulating Cell Proliferation

胃癌是侵袭性极强的恶性肿瘤之一，早期诊断率低，转移率高。尽管胃癌在治疗方面已经取得了一定的进展，但为了寻求更佳的治疗手段，需要更好地了解其潜在发病机制和新的治疗靶点。驱动蛋白超家族23基因（KIF23），在细胞质分离、轴突生长等多种细胞过程中发挥重要作用。目前，KIF23已被发现在多种肿瘤组织和细胞中高表达，提示KIF23与肿瘤发生有潜在的联系。在本篇研究，作者发现KIF23的表达与胃癌的不良预后相关，且与肿瘤分期（pTNM）有关。体外实验证明，KIF23的缺失对胃癌细胞的增殖有明显的抑制作用；此外，KIF23基因敲低可显著抑制小鼠胃癌细胞的增殖，并显著下调肿瘤细胞增殖因子Ki67和PCNA的表达。综上所述，这些数据表明KIF23可能是胃癌的一个潜在治疗靶点。

KIF23在人胃癌细胞中敲低效果

2、慢病毒案例

文章题目：Tumor cell-derived EMP1 is essential for cancer-associated fibroblast infiltration in tumor microenvironment of triple-negative breast cancer

乳腺癌（BC）是女性常见的恶性肿瘤之一，三阴性乳腺癌（TNBC）是一种侵袭性强、易转移且缺乏有效治疗靶点的乳腺癌亚型，靶向肿瘤微环境（TME）中的癌症相关成纤维细胞CAFs被认为是治疗TNBC患者的有效策略。上皮膜蛋白1（EMP1）的异常表达在肿瘤进展和转移中起着至关重要的作用，然而，EMP1在TNBC中的生物学作用和分子机制尚未阐明。在本研究中，作者利用一种靶向EMP1的4 in 1 shRNA慢病毒，并通过qRT-PCR和WB实验证实了其敲低效率。实验表明，敲低EMP1明显抑制了TNBC细胞系的生长速度、细胞增殖、迁移和侵袭能力，证实了EMP1在TNBC细胞中发挥癌基因的作用。

Lv-4 in 1-shEMP1在MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞的敲低效果

文章题目：PDGFD switches on stem cell endothelial commitment

胚胎干细胞(ESCs)来源于囊胚期胚胎的内细胞团(ICM)，具有自我更新和多能性，在再生医学中具有巨大的治疗潜力，很多心血管疾病常与血管内皮细胞(EC)功能受损有关，因此，从ESCs中提取健康的ECs一直是该领域关注的焦点，然而，调控ESC向血管细胞分化的关键分子和机制仍然知之甚少。尽管已知血小板衍生生长因子(PDGF)家族成员PDGFD在胚胎发育期间表达，但PDGFD是否在ESC调控中发挥作用仍然未知。本研究利用功能获得和功能丧失实验，结合生物信息学分析和多个模型系统，证实PDGFD是启动胚胎干细胞(ESCs)内皮定型的重要因素。PDGFD基因缺失或敲低抑制ESC向EC谱系分化，增加ESC自我更新，PDGFD过表达激活ESC向ECs分化。该研究结果为PDGFD作为ESC命运决定的新调控因子提供了新的见解。

Lv-4 in 1-shPdgfd介导ESCs中PDGFD的表达下调

3、腺病毒案例

文章题目：A clinical-stage Nrf2 activator suppresses osteoclast differentiation via the iron-ornithine axis

绝经后骨质疏松症是在缺乏雌激素的情况下由破骨细胞过度活化引起的代谢紊乱。骨密度(BMD)降低使患者更易患髋部或椎体脆性骨折，在全球范围内造成严重残疾和社会经济负担。通过小分子激活Nrf2是治疗绝经后骨质疏松症的一种很有前途的策略，然而，目前还没有批准用于治疗慢性疾病的Nrf2激活剂，且Nrf2调控破骨细胞分化的下游机制仍尚不清楚。本研究确定了一种新型临床阶段Nrf2激活剂-bitopertin，该激活剂通过Nrf2-铁鸟氨酸途径抑制破骨细胞分化并改善雌激素消耗诱导的骨质流失。在RANKL治疗的BMDMs中，Nrf2激活剂bitopertin降低了细胞内铁水平，但在Nrf2-/- BMDMs中，这种降低是逆转的。随后，通过腺病毒shRNA敲低Slc40a1的表达，发现Slc40a1沉默减弱了bitopertin的降铁作用，表明Slc40a1是Nrf2调控破骨细胞铁代谢的重要效应因子。

腺病毒4in1 shRNA敲低铁转运蛋白的WB验证和定量分析

文章题目：Synergistic regulation of SLC7A11 and glucose-6-phosphate dehydrogenase in redox homeostasis governs decidualization: a mechanistic insight into adenomyosis-related infertility

子宫腺肌症影响着超过20%的育龄期女性，是不孕的主要原因。子宫内膜间质细胞（ESCs）的蜕膜化缺陷是子宫腺肌症的一个关键病理特征；然而，其背后的氧化还原-代谢机制仍不清楚。本研究将铁死亡定位为子宫腺肌症中铁代谢失调与蜕膜化缺陷之间的机制桥梁，并确定了SLC7A11–G6PD轴是一种氧化还原保护机制，它界定了一个允许铁存在的分化窗口。在临床上，该研究数据表明SLC7A11值得作为子宫内膜容受性生物标志物进行评估。

Ad-4in1 shSLC7A11感染后ESCs中IGFBP1、SLC7A11和G6PD的蛋白表达

3、AAV案例

文章题目：TNF-α-dependent neuronal necroptosis regulated in Alzheimer’s disease by coordination of RIPK1-p62 complex with autophagic UVRAG

阿尔茨海默病(AD)是一种常见的神经退行性疾病，临床表现为认知功能障碍和记忆力减退等。研究表明，AD发病的病理过程可能与神经元坏死和自噬有关。神经元坏死是AD的主要特征，程序性细胞坏死与AD的发病机制相关。自噬受损导致Tau蛋白的积累，这是包括AD在内的大多数神经退行性疾病（NDs）的特征。TNF-α作为关键促炎因子，其诱导的炎症可能对神经元死亡产生不利影响，但在AD发病过程中TNF-α的升高是否能引起神经元坏死还尚未可知。本研究利用来自AD患者的脑组织和AD小鼠模型，通过免疫组织化学 (IHC) 染色和免疫印迹法测定坏死信号通路中关键基因的表达，发现TNF-α/TNFR1信号通路在AD神经元坏死激活中发挥作用。在TNF-α刺激下，积累的p62 招募 RIPK1并诱导其自我寡聚，激活下游 RIPK1/RIPK3/MLKL级联反应，导致神经元坏死。进一步研究发现，p62的异常积累是由TNF-α诱导的UVRAG下调介导的自噬损伤引起的。本研究揭示了AD发病过程中神经元坏死和自噬机制之间的联系，为AD的临床干预提供了潜在的靶点，同时也为其他NDs的细胞死亡调节机制的探索提供了基础。

AAV介导的shRNA敲低效率的验证

文章题目：FAM3A maintains metabolic homeostasis by interacting with F1-ATP synthase to regulate the activity and assembly of ATP Synthase

线粒体功能障碍在糖尿病等代谢性疾病的发病机制中起着至关重要的作用，主要表现有ATP合成减少和ROS产生增加，这与ATP合酶(ATPS)在疾病发生时组装及活性下降有关。FAM3A蛋白是序列相似家族3成员之一，主要位于肝细胞、胰腺β细胞、脂肪细胞和血管平滑肌细胞的线粒体中，研究报道FAM3A的激活可以逆转肥胖糖尿病小鼠的高血糖和脂肪变性，并通过改善线粒体功能障碍保护各种细胞类型免受氧化诱导的死亡，这些调控作用均与FAM3A可促进ATP的产生与释放相关。本研究确定了线粒体蛋白FAM3A是一种新型的ATPS活性成分，FAM3A与F1-ATPS相互作用，首先增加ATP的产生和释放，释放的ATP通过激活FOXD3增强ATPS的能力，促进FAM3A对ATP产生和ROS抑制的作用。

AAV-shFOXD3降低了小鼠肝脏中FOXD3和ATPS关键亚基的mRNA水平

文章题目：Slow Metabolism–Driven Amplification of Hepatic PPARγ Agonism Mediates Benzbromarone-Induced Obesity-Specific Liver Injury

肥胖与非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是药物性肝损伤（DILI）的危险因素。先前研究表明，苯溴马隆（BBR）是一种治疗痛风和高尿酸血症的常用药物，它会加剧肝脂肪变性和肝损伤，特别是在肥胖个体中。然而，其具体机制尚未阐明。本研究通过多组学、药理学和药代动力学方法，发现BBR诱导的肥胖特异性DILI主要是通过增强PPARγ信号通路。肥胖的db/db小鼠肝脏药物代谢能力下降，导致肝脏内BBR滞留时间延长，这种延长增强了其对PPARγ的激动作用，从而加剧了肝脏脂质积累并最终引发肥胖特异性DILI。强调了肥胖或已有NAFLD患者肝脏药物代谢能力降低在临床实践和药物发现过程中的重要性。

免疫组化和WB证实AAV8-PPARγ-shRNA成功转染并显著敲低PPARγ水平

文章题目：c-Myc-PANK3-EMT axis regulates the structure and function of intestinal barrier in ulcerative colitis c-Myc-PANK3-EMT axis regulates UC intestinal barrier integrity

炎症性肠病（IBD）含溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD），呈慢性复发性，全球患病率激增，现有治疗存在疗效不佳、复发率高、副作用明显等问题。肠道屏障是肠道稳态的核心，其损伤先于IBD疾病进展，修复屏障完整性是IBD治疗的重要方向，但相关机制未明确，缺乏有效靶点。本研究揭示了c-Myc-PANK3-EMT 轴在维持肠屏障结构和功能完整性中发挥关键作用，PANK3是UC肠屏障修复的潜在靶点，而叶酸是PANK3的候选激动剂。转录组分析揭示PANK3抑制EMT相关基因，PANK3过表达显著降低PI3K、AKT和ERK的磷酸化水平，PANK3敲低则导致这些信号分子磷酸化水平升高。体外实验表明，完全去除泛酸（PANK3底物）会取消PANK3激动剂或过表达对屏障的保护作用，说明PANK3的功能依赖于其代谢酶活性。

体内结肠PANK3敲低效果验证