在CAR-T细胞产品的生产质控中，放行质量检测周期与产品生命周期错配始终是质量控制的焦点难题。产品制备已经完成，患者已准备就绪，而支原体检查传统法（培养法）长达28天的检测周期，往往远超细胞治疗产品仅数天的有效期。这一矛盾，在先进治疗药品（ATMPs）领域尤为突出——每延迟一天放行，患者生存窗口就缩小一分。

传统培养法不仅周期长，还存在"活的非可培养状态"（VBNC）支原体漏检风险；指示细胞培养法虽缩短至7-10天，但操作繁琐，时间上仍然无法满足快速放行需求。核酸扩增技术（NAT）的出现，为这一问题提供了技术层面的解决方案。基于支原体特异性DNA序列的扩增与检测，NAT方法可将检测周期缩短至3-5小时，实现真正意义上的“快检放行”。

一、2026监管新规：NAT地位确立与技术框架升级
2026年对于支原体NAT检测而言是关键的历史性节点，《欧洲药典》（12.2版）2.6.7“支原体（MYCOPLASMAS）”章节于4月1日正式更新生效，NAT法再次明确为与培养法、指示细胞培养法并行的三大核心方法之一。这意味着，在经过充分验证的前提下，NAT法已具备替代传统药典方法的合规基础。

新版EP关于NAT法的主要技术更新包括：
①检测范围扩展与分类细化：明确涵盖柔膜体纲（Mollicutes），包括支原体属、脲原体属、无胆甾原体属及螺原体属等，检测范围扩大，分类更细化。

②取样策略的科学性提升：强调由于支原体可能附着或存在于细胞内，检测时应同时取样细胞和上清液。

③抑制物测试的强制性要求：与培养法一致，指示细胞培养法和核酸法均新增抑制物测试，并提出了具体方案和测试内容，旨在排除产品基质对PCR反应的干扰。

④验证标准量化：引入WHO支原体DNA国际标准品作为校准工具，并明确规定GC/CFU比率＜10的参考品接受标准，使NAT结果更具可比性。

二、方法学验证：NAT快检的合规通道
对于细胞治疗企业而言，采用NAT方法的核心顾虑在于监管合规性。目前，《欧洲药典》（EP）、《日本药典》（JP）以及《美国药典》（USP）均已收录NAT方法作为支原体检测方法；2025版《中国药典》虽尚未正式收录，但也明确指出“也可采用经国家药品检定机构认可的其他方法”。各国药监机构对支原体检测方法的认可逻辑高度一致：新方法可以接受，但必须证明其不劣于现有方法。

根据2022年国家药监局药审中心发布的《细胞治疗产品药学研究与评价技术指导原则》（试行），在样品量有限或需要快速放行的特殊情况下，如药典方法无法满足，可考虑开发新型检测方法，但必须经过充分验证。NAT法的验证路径主要围绕可比性研究展开，即证明新方法不劣于于或优于传统方法：