纤维化是多种慢性疾病的终末共同病理改变，累及肺、肝、肾、心脏、皮肤等多个器官，核心特征是成纤维细胞异常活化、细胞外基质（ECM）过度沉积、胶原大量堆积，最终导致器官硬化、功能衰竭。在所有促纤维化信号中，TGF-β/SMAD通路是公认的核心主控通路，直接调控纤维化标志性基因COL1A1（Ⅰ型胶原）的转录与表达，是当前抗纤维化药物研发的绝对核心靶点。

一、TGF-β1/SMAD 通路基础介绍
TGF-β1是人体内最强的内源性促纤维化细胞因子，几乎所有器官纤维化的启动、进展、恶性循环，均依赖该通路的持续激活，而SMAD蛋白是通路的核心信号转换器，COL1A1是通路最终功能输出标志。

1. 通路上游激活：信号启动
组织损伤、慢性炎症、氧化应激会大量释放TGF-β1，启动级联反应：
TGF-β1首先结合细胞膜受体TGFβRⅡ，继而招募并磷酸化激活下游激酶受体ALK5（TGFβRⅠ），完成细胞膜信号向胞内的传递。

2. 核心枢纽：SMAD蛋白活化（科研核心检测靶点）
活化的ALK5特异性磷酸化下游受体型SMAD（R-SMAD），是通路激活的核心标志：
- p-SMAD2、p-SMAD3：活化核心指标，磷酸化后才具备信号传导功能
- SMAD4：通用协同蛋白，与p-SMAD2/3结合形成异源三聚体
- SMAD6、SMAD7：内源性负反馈抑制因子，可阻断ALK5活化，抑制纤维化进展

激活后的SMAD复合物会快速转位进入细胞核，结合靶基因启动子的SBE元件，启动纤维化相关基因的大规模转录。

3. 下游功能输出：COL1A1主导胶原沉积
COL1A1是编码Ⅰ型胶原α1链的关键基因，是评估纤维化严重程度、评价药物抗纤维化疗效的直接、核心终点指标。
正常组织中COL1A1低表达，当TGF-β/SMAD通路异常激活时，其mRNA和蛋白水平会显著上调，造成大量胶原沉积。

4. 纤维化恶性循环机制
肌成纤维细胞活化后会自分泌大量TGF-β1，持续激活SMAD通路，不断合成COL1A1等胶原，导致胶原不可逆堆积、器官瘢痕化、功能持续衰退。

图：TGF-β1/SMAD 通路示意图

From：Randall LJ, Bajan S, Tran TD, Harvey RJ, Russell FD. Propolis compound inhibits profibrotic TGF-β1/SMAD signalling in human fibroblasts. Sci Rep. 2025;15(1):27260. Published 2025 Jul 26. doi:10.1038/s41598-025-07918-2

二、抗纤维化药物研发最新进展
当前抗纤维化药物研发以TGF-β/SMAD通路为核心，覆盖上市药物、临床在研新药，涵盖小分子、单抗、天然产物等多个赛道。

1。临床已上市一线抗纤维化药物

2.临床在研核心新药
· ALK5小分子抑制剂（最热门靶点）
代表药物：Galunisertib、SB-525、SD-208；直接阻断SMAD2/3磷酸化，强效下调COL1A1，用于肝纤维化、硬皮病、肾纤维化，处于Ⅰ/Ⅱ期临床。

· TGF-β中和单抗
Fresolimumab、NIS793：靶向中和TGF-β配体，阻断通路上游激活，布局NASH肝纤维化、系统性硬化症。

· 下游靶向药物
FG-3019（抗CTGF单抗）：阻断SMAD下游促胶原信号；TDI01（ROCK2抑制剂）：国产First-in-class，抑制肝星状细胞活化，下调p-SMAD3与COL1A1。

· 核受体激动剂（间接通路调控）
奥贝胆酸、Resmetirom（FXR激动剂）、PPARα/γ激动剂，广泛用于NASH肝纤维化临床研发，通过抑制细胞活化间接减弱SMAD通路活性。

三、高通量筛选相关检测（细胞水平）
✅ 通路机制SMAD验证（核心必做）
1、THUNDER™ Phospho-SMAD2 (S465/S467) TR-FRET 检测试剂盒
THUNDER TR-FRET采用经典的双抗夹心检测模型检测磷酸化蛋白水平，两个标记了荧光Eu和FR的抗体分别识别蛋白磷酸化表位和稳定区表位，抗体结合拉进荧光基团，320nm激发后进而产生FRET（荧光共振能量转移），从而在665nm检测荧光信号值。

THUNDER检测技术特异性好，灵敏度高，重复性好，通量高，操作简单，手动15min即可完成实验。

图：THUNDER™ Phospho-SMAD2 (S465/S467) TR-FRET检测原理及检测流程

图：THUNDER™ Phospho-SMAD2 (S465/S467) TR-FRET检测数据

2、THUNDER™ Phospho-SMAD3 (S423/S425) +Total SMAD3 TR-FRET检测试剂盒
THUNDER TR-FRET采用经典的双抗夹心检测模型检测磷酸化和总蛋白水平，两个标记了荧光Eu和FR的抗体分别识别蛋白磷酸化/总蛋白表位和稳定区表位，抗体结合拉进荧光基团，320nm激发615nm后进而产生FRET（荧光共振能量转移），从而在665nm检测荧光信号值。

THUNDER检测技术特异性好，灵敏度高，样本用量少，重复性好，操作简便，无需洗涤步骤，手动15min即可完成实验。

图：THUNDER™ Phospho-SMAD3 (S465/S467) +Total SMAD3 TR-FRET检测原理及检测流程

图：THUNDER™ Phospho-SMAD3 (S465/S467) +Total SMAD3 TR-FRET示例数据

✅ 纤维化表型COL1A1定量
Human COL1A1
THUNDER细胞因子检测是基于双抗体夹心法，标记荧光供体和受体的Human COL1A1 抗体Eu-Ab1和FR-Ab2，分别与样品中COL1A1结合，产生能量共振转移FRET（615nm），进而产生665nm荧光信号，荧光信号强度与COL1A1浓度成正比。全程仅需1.5h，免洗，可高通量。检测灵敏度高，上限宽。

图：Human COL1A1 检测原理，流程

Human COL1A1 检测范围：29 – 100,000 pg/mL

图：Human COL1A1 标曲

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