实验背景
心血管疾病致死致残率高，心肌细胞中Ca²⁺不仅触发收缩，还作为第二信使调控代谢。近年证实，线粒体Ca²⁺稳态失衡是心衰、缺血-再灌注损伤及心律失常的关键病理环节，其动态可视化定量分析已成为研究热点。

体外研究中，NRVM原代细胞高度保留在体功能特性，是基础与转化的“桥梁”模型；H9c2细胞系增殖快、遗传均一、便于基因操作。两者联合使用，可兼顾功能保真性与实验可操作性，形成从机制探索到功能验证的完整链条。

通过负载Rhod‑2 AM等线粒体靶向探针或mito‑R‑GECO1基因编码指示剂，结合高速相机记录荧光信号，可监测“电‑钙”耦联及线粒体Ca²⁺动态。



本实验旨在建立一套涵盖NRVM及H9c2的标准化线粒体钙信号标测流程，为系统评估疾病或药物干预下的线粒体钙处理缺陷及能量代谢障碍提供清晰可重复的操作指南，助力心血管重大疾病机制研究与药物筛选。

Protocol（乳鼠心室肌细胞（NRVM）及H9c2细胞线粒体钙信号标测）

一、实验试剂
（1）无钙台氏液：

（2）Rhod-2 AM染色液的配制（碧云天线粒体钙离子检测试剂盒，S1062S）：

（3）Digitonin透化液：用无钙台氏液将10 mM Digitonin浓储稀释成10 μM稀释液
（4）细胞完全培养基：
NRVM细胞：DMEM/F12+10% FBS+ 1%P/S
H9c2细胞：DMEM 高糖+10%FBS+1%P/S

二、细胞透化及染色操作流程
1. 将Rhod-2 AM染色液加入事先准备好的细胞中，细胞融合度30%。4 ℃染色30 min，37 ℃培养箱染色20 min。
2. 弃上清，无钙台氏液洗去残余染料。
3. 加入10 μM Digitonin室温透化（NRVM透化2-4 min， H9c2细胞透化5-8min，可观察细胞状态进行相应调整）。
4. 弃上清，无钙台氏液清洗两遍。
5. 上机检测。
实验一：肌浆网线粒体-线粒体肌浆网钙摄取传递功能检测
通过细胞收缩与钙成像设备荧光显微镜实时记录咖啡因诱导下线粒体钙摄取动态变化，并设置线粒体钙单向转运体（MCU）特异性抑制剂Ru360干预组，探究MCU介导的线粒体钙摄取功能。

实验二：ISO、Amiodarone单独及联合干预对NRVM线粒体钙动态信号的影响
分组设置：
● 空白对照组（Control）：常规完全培养基，37 ℃培养，无任何药物；
●异丙肾上腺素（ISO）组：加入5 μmol/L ISO，开始检测；
● 胺碘酮（Amiodarone）组：加入0.5 μmol/L Amiodarone，开始检测；
●Amiodarone+ISO组：0.5 μmol/L Amiodarone预处理30 min，更换含5 μmol/L ISO，开始检测。
全程实时连续监测细胞线粒体钙荧光动态变化，以标准化荧光值ΔF/F0定量反映线粒体钙水平。

6. 数据分析。
采用OMapScope 5软件完成实验数据解析，同步输出静态荧光成像图、时序曲线及实时动态荧光视频文件。

三、实验结果
1.Digitonin透膜效果验证

未经10 μM Digitonin室温透膜处理时，20×与40×放大视野下均可见整体弥散性弱荧光，胞浆与线粒体区域荧光无明显区分，无法分辨出线粒体特异性钙信号：经Digitonin选择性通透细胞膜（不破坏线粒体膜）处理后，胞浆游离钙离子随膜孔流出细胞，胞浆背景荧光显著消退，线粒体特异性钙荧光信号被清晰凸显。

结果表明，Digitonin选择性透膜处理可有效洗脱胞浆游离钙，去除胞质钙荧光背景干扰；Rhod-2AM标记结合该透膜方案，能够特异性、清晰地显示NRVM和H9c2中线粒体钙的荧光信号，大幅提升线粒体钙成像对比度，是观测心肌细胞线粒体钙稳态可靠的成像预处理手段。

2.MCU介导的肌浆网-线粒体钙摄取功能

经 Digitonin 选择性透化的 NRVM 线粒体钙实时动态成像（Rhod-2 AM 标记）

咖啡因刺激下NRVM线粒体钙信号的动态实时成像与时序分析

咖啡因通过激动心肌细胞肌浆网上的兰尼碱受体（RyR），促使肌浆网内储存的钙离子快速大量释放至胞浆，人为制造胞浆钙浓度骤升的内源性钙源；随后线粒体内膜上的线粒体钙单向转运体（MCU）顺电化学梯度将胞浆钙离子转运进入线粒体基质，引发线粒体钙水平升高；实验经Digitonin选择性透化细胞膜洗脱胞浆背景荧光后，即可通过线粒体靶向钙探针的荧光上升速率、峰值幅度定量反映线粒体钙摄取功能，搭配MCU特异性抑制剂Ru360还可验证该钙摄取过程的通路特异性。

3.ISO、Amiodarone单独及联合干预对NRVM线粒体钙动态信号的影响

β受体激动剂ISO可显著促进NRVM线粒体钙摄取，诱导线粒体钙超载；而抗心律失常药物胺碘酮（Amiodarone） 可显著降低心肌细胞线粒体钙稳态水平，拮抗ISO介导的线粒体钙超载现象。提示二者对心肌线粒体钙转运具有截然相反的调控作用，Amiodarone具备缓解β过度激活所致线粒体钙超载的潜在效应。

参考文献：
1. Delmotte P, Yang B, Thompson MA, Pabelick CM, Prakash YS, Sieck GC. Inflammation alters regional mitochondrial Ca²⁺ in human airway smooth muscle cells. Am J Physiol Cell Physiol. 2012;303(3):C244-C256. 
2. Fernandez-Sanz C, Ruiz-Meana M, Miro-Casas E, et al. Defective sarcoplasmic reticulum-mitochondria calcium exchange in aged mouse myocardium. Cell Death Dis. 2014;5(12):e1573. Published 2014 Dec 18. 
3. Pronto JRD, Mason FE, Rog-Zielinska EA, et al. Impaired Atrial Mitochondrial Calcium Handling in Patients With Atrial Fibrillation. Circ Res. 2025;137(11):1333-1352.

本实验由河南省医学科学院电生理研究所与斯高研究院联合共创，如您对相关技术感兴趣，欢迎前来河南省医学科学院电生理研究所参观交流 。