细胞增殖、周期、凋亡、迁移与侵袭是决定细胞生长、稳态及恶性进展的核心生物学表型，也是细胞生物学机制研究、基因功能验证与药物活性评价的五大关键检测体系。本文中小编对以上五种经典细胞功能检测进行统一梳理与总结，帮你快速搞定PPI研究，高效推进科研实验！

1、细胞凋亡检测
细胞凋亡（Apoptosis）是细胞在基因调控下主动、有序地死亡的过程，区别于细胞坏死。

检测目的：定量检测细胞程序性死亡水平，区分细胞主动凋亡与被动坏死，验证基因或药物是否通过激活凋亡通路诱导细胞死亡，阐明细胞活力下降、增殖抑制的核心机制。

检测场景：药物诱导肿瘤细胞死亡机制研究；验证凋亡相关基因的功能；细胞氧化损伤、应激损伤后的细胞死亡检测；肿瘤耐药、放疗增敏机制研究。

形态学特征：
· 细胞皱缩：胞质浓缩，细胞体积变小，胞膜完整；
· 染色质固缩：细胞核染色质聚集在核膜内侧，呈致密斑块；
· 核碎裂：核膜破裂，DNA 被核酸内切酶切割为180–200bp 梯度片段（琼脂糖电泳呈特征 “DNA ladder”）；
· 凋亡小体形成：细胞膜出芽包裹碎裂核与胞质，形成多个膜包裹的囊泡（凋亡小体）；
· 清除：周围巨噬细胞 / 邻近细胞快速吞噬凋亡小体，无胞内物质外泄，不诱发炎症。

生化特征：
磷脂酰丝氨酸（PS）外翻
Caspase（半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶）级联激活
线粒体膜电位下降，细胞色素 C 释放
DNA断裂并形成DNA ladder

检测方法：

（1）Annexin V-FITC/PI双染流式法
原理：
凋亡早期细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻，Annexin V特异性结合；PI无法穿透完整活细胞膜、可穿透破损晚期凋亡/坏死细胞膜，双荧光区分四群细胞：活细

胞、早期凋亡、晚期凋亡、坏死细胞。

检测步骤
收集新鲜各组细胞，PBS洗涤→结合液重悬细胞→依次加入Annexin V-FITC与PI染液，避光室温孵育→过筛制备单细胞悬液→1 h内流式细胞仪上机检测→区分活细胞、早期凋亡、晚期凋亡、坏死细胞并统计比例。

（2）TUNEL染色法
原理
细胞凋亡后期，激活的核酸内切酶会切割核 DNA，产生大量3’-OH 黏性末端缺口；TdT（末端脱氧核苷酸转移酶）识别 DNA 断裂产生的游离 3’-OH 末端，并将标记好的 dUTP 连接到 DNA 断口处。

检测步骤
细胞爬片制备、各组处理后固定→通透处理打破细胞膜→加入TUNEL反应液避光孵育→DAPI复染细胞核→荧光显微镜观察成像→统计细胞核阳性染色比例，评估细胞凋亡水平。

（3）Caspase-3/9活性检测、WB凋亡相关蛋白验证
原理
Caspase-3/9是凋亡信号通路中关键的执行分子，Caspase-3/9平时以无活性的酶原形式存在，只有在凋亡信号刺激下才会被切割激活。
· 若Caspase-9升高而Caspase-3未升高：凋亡处于早期启动阶段，或存在上游阻断
· 若两者均升高：凋亡已全面激活，进入执行阶段
· 若仅Caspase-3升高：可能通过外源性途径（如Fas/FasL）激活

凋亡相关蛋白检测：
Caspase家族：Caspase平时以无活性前体存在，凋亡时被切割激活。WB检测的是活化片段的出现，而非总蛋白上调。

Bcl-2家族：
Bcl-2/Bax比值是经典指标：比值降低提示凋亡倾向增加。

凋亡执行底物（PARP等）
PARP切割是Caspase-3活化的经典下游证据，常与Caspase-3活化片段同时检测。

检测步骤
提取各组细胞总蛋白→采用Caspase活性检测试剂盒孵育反应→酶标仪检测对应吸光度，统计Caspase相对活性；或通过WB电泳、转膜、孵育一抗二抗→检测Cleaved-Caspase3/9、Bax、Bcl-2等凋亡蛋白表达水平，验证凋亡通路激活状态。

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2、细胞增殖
细胞增殖指细胞通过分裂实现细胞数量扩增、细胞体积增大的生物学过程，是评估细胞活力、生长速率等的核心基础表型；

检测目的：定量评估细胞生长活力、增殖速率及细胞存活状态，明确基因干预、药物处理、环境胁迫等实验条件对细胞生长的促进或抑制作用，是细胞功能研究最基础的验证实验。

检测场景：初筛基因过表达/敲低对细胞生长的影响；检测抗肿瘤、抗氧化等药物的细胞毒性与增殖抑制效果；对比不同培养条件、处理时长下的细胞活力差异；课题前期细胞功能表型基础验证。

形态学特征：
细胞体积变化：细胞增大，胞质丰富，核质比降低（分裂期除外）；
细胞密度增加：培养细胞间隙变窄，出现"接触"或"重叠"现象；
核形态：核增大，核仁明显（rRNA合成旺盛），染色质疏松（常染色质为主）；
有丝分裂像：可见染色体凝集、排列、分离等分裂期形态
生化特征：DNA复制活跃，代谢增强

检测方法

（1）CCK-8法
原理：CCK-8的核心成分是水溶性四唑盐WST-8，被活细胞线粒体脱氢酶还原生成橙黄色水溶性甲瓒产物，颜色深浅与活细胞数量正相关，酶标仪检测450nm吸光度值。
检测步骤：细胞消化计数，按合适密度接种于96孔板→常规培养至细胞贴壁→按实验分组进行药物/基因干预处理→分别培养24 h、48 h、72 h等时间点→每孔避光加入适量CCK-8试剂，避光孵育1–2 h→酶标仪450 nm波长检测吸光度→统计细胞存活率、抑制率并绘制生长曲线。

（2）MTT法
原理：线粒体脱氢酶还原MTT生成不溶性蓝紫色甲瓒结晶，DMSO溶解后测570nm吸光值。
检测步骤：96孔板接种细胞并分组处理→培养至预设时间→每孔加入MTT工作液，继续孵育4 h→弃去孔内培养基，每孔加入DMSO充分震荡溶解结晶→酶标仪570 nm处检测吸光度→计算细胞增殖活力与抑制率。

（3）EdU增殖染色法
原理：EdU胸腺嘧啶类似物掺入S期复制DNA，荧光标记靶向结合，直接标记增殖期细胞，可成像+流式定量。
检测步骤：细胞铺板并分组干预培养→加入EdU工作液孵育，使其掺入S期新生DNA→固定细胞、透膜处理→加入荧光标记试剂避光孵育染色→洗涤去除未结合染料→荧光显微镜成像或流式上机检测→统计阳性增殖细胞比例。

（4）CFSE检测
原理：CFSE（5,6-羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯）是一种可穿透细胞膜的荧光染料，进入细胞后产生能发出明亮荧光的羧基荧光素琥珀酰亚胺酯。进行有丝分裂时，标记的荧光蛋白分到两个子细胞中，导致每个子细胞的荧光强度减半。通过流式细胞仪检测，可以观察到荧光强度呈指数级递减的细胞群体，形成特征性的" generations"（代次）峰图。
检测步骤：溶液配制→细胞标记→流式细胞仪或者荧光显微镜观察

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3、细胞周期检测
细胞周期分为G0/G1期（DNA合成前期）、S期（DNA合成期）、G2期（分裂前期）、M期（分裂期）。
检测目的：探究细胞增殖快慢的分子机制，明确外界干预或基因调控导致的细胞周期阻滞位点，解释细胞增殖加快或减慢的根本原因，为增殖表型结果提供机制支撑。
检测场景：增殖实验出现显著差异后，深挖其调控机制；验证药物、基因是否通过阻滞细胞周期抑制肿瘤生长；研究细胞静止、活化状态转换；筛选周期靶向干预药物。

形态学特征：
G1期：核膜完整，染色质疏松（常染色质），核仁明显
S期：染色质部分凝集，可见DNA复制灶
G2期：核增大，染色质进一步凝集，中心体开始分离
M期：细胞分裂
生化特征：
· G0/G1 期：二倍体 DNA（2n），DNA 最少，流式第一个主峰；
· S 期：DNA 正在复制，含量 2n～4n 之间，主峰和 G2/M 峰之间的宽弥散区；
· G2/M 期：DNA 复制完成，四倍体（4n），第二个主峰，荧光强度≈G1 峰 2 倍。

检测方法：

（1）PI单染流式细胞术
原理：碘化丙啶PI穿透固定细胞膜，特异性结合细胞核DNA，荧光强度与DNA含量成正比，流式细胞仪根据 G0/G1 (2n)、S (2n~4n)、G2/M (4n) 不同 DNA 倍体对应的荧光强度区分各周期细胞群。
检测步骤：收集各组贴壁/悬浮细胞，PBS清洗→预冷75%乙醇4℃固定过夜→次日离心弃固定液，PBS重悬洗涤→加入含RNase A的PI染色工作液，避光孵育30 min→过筛去除细胞团块→流式细胞仪上机检测

（2）Ki-67免疫荧光/流式联合周期检测
原理：细胞处在增殖周期（G1/S/G2/M），会表达 Ki-67；彻底休眠的 G0 细胞，完全不表达 Ki-67；
①Ki67⁻ 2n → G0 静息 ② Ki67⁺ 2n → G1 活跃间期 ③ Ki67⁺ 2n~4n → S 期 ④ Ki67⁺ 4n → G2/M 期
检测步骤：细胞固定透膜后封闭→滴加Ki-67一抗4℃孵育过夜→荧光二抗避光孵育→PI复染细胞核→荧光显微镜观察或流式上机检测→区分G0静止细胞与G1/S/G2/M增殖细胞，精准统计增殖细胞比例。

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4、细胞迁移实验
细胞迁移指细胞无基质屏障、自主定向移动能力，模拟体内细胞爬行、转移、创面愈合过程；肿瘤细胞迁移能力决定原位侵袭、远端转移潜能，也用于内皮细胞、成纤维细胞创面修复研究。

检测目的：评估细胞的自主移动、定向爬行能力，直观反映肿瘤细胞的转移潜能或正常细胞的创面修复能力，是肿瘤转移、组织修复研究的核心表型。

检测场景：研究基因、药物对肿瘤细胞转移能力的调控；验证上皮间质转化（EMT）表型；检测内皮细胞、成纤维细胞的创面愈合能力；筛选抗肿瘤转移药物。

形态学特征：
细胞整体形态改变，获得前后极性；
前端运动突起，伪足伸出；
细胞后端形成狭窄收缩尾

检测方法

（1）划痕实验
原理：细胞长满单层后无菌枪头划一平直划痕，去除划痕内细胞，定时拍照观测细胞向划痕空白区域爬行闭合程度。
检测步骤：6孔板接种细胞，培养至完全铺满单层细胞→无菌直尺辅助、枪头垂直均匀划痕→PBS轻柔洗涤3次，去除脱落漂浮细胞→加入无血清培养基培养→分别在0 h、24 h、48 h倒置显微镜拍照→测量划痕宽度，计算创面愈合率。

（2）Transwell迁移小室实验
原理：无基质胶Transwell小室，上下室血清浓度差构建趋化梯度，细胞自发穿滤膜微孔迁移至下室，固定染色计数。
检测步骤：Transwell无胶小室置于24孔板中→上室加入无血清培养基稀释的细胞悬液→下室加入含10%血清的完全培养基构建趋化梯度→常规培养24–48 h→取出小室，棉签擦除上室未迁移细胞→多聚甲醛固定、结晶紫染色→水洗晾干，显微镜随机视野拍照计数迁移细胞数。

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5、细胞侵袭实验
细胞侵袭是指肿瘤细胞突破基底膜&细胞外基质、侵袭周围组织的过程。
检测目的：评估细胞降解细胞外基质、突破基底膜屏障的浸润转移能力，相较于迁移实验，更真实反映肿瘤细胞恶性侵袭、远端转移的体内潜能，是肿瘤恶性程度的核心评价指标。
检测场景：迁移实验验证有差异后，进一步验证肿瘤恶性转移能力；研究MMP家族、EMT通路对肿瘤侵袭的调控；高分期刊肿瘤转移机制深度验证；抗侵袭、抗转移药物效果评价。

形态学特征：
细胞形态变狭长、间质样（EMT 形态）
大量运动伪足、侵袭伪足
分散生长、集群迁移条索

检测方法

（1）基质胶Transwell侵袭实验
原理：Transwell上室提前铺模拟体内基底膜基质，细胞分泌MMP酶降解基质胶、穿透滤膜完成侵袭，下室血清趋化诱导。
检测步骤：预冷条件下Matrigel基质胶稀释，均匀铺于Transwell上室→37℃孵育凝固成模拟基底膜→上室接种无血清细胞悬液，下室加完全培养基→培养24–48 h→棉签彻底擦除上室残留细胞→固定、结晶紫染色、晾干→显微镜随机视野拍照，统计穿膜侵袭细胞数量。

（2）3D基质球侵袭实验
原理：体内实体瘤是多细胞紧密聚集的细胞团，被基底膜、胶原等细胞外基质（ECM）包裹；肿瘤侵袭本质是细胞团整体突破基质屏障、向外浸润。
检测步骤：制备低浓度基质胶3D培养体系→细胞与基质胶混合均匀铺板→37℃培养箱长期培养→定时显微镜观察细胞球向外浸润生长状态→测量各组细胞球侵袭浸润半径与面积，统计侵袭能力差异。

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