猪胰岛素ELISA检测的完整标准化操作步骤
2026-07-30 来源:本站 点击次数:33
针对猪胰岛素ELISA完成洗刷环节全流程优化、洗涤液配方确认的背景，以下是该检测的完整标准化操作步骤：
一、实验前准备
提前30分钟将试剂盒从2~8℃冰箱取出，所有试剂平衡至室温，确认浓缩洗涤液无结晶析出，按标准配方配制好1×工作洗涤液。
猪血清样本提前3000rpm离心15分钟，去除乳糜微粒与纤维蛋白沉淀，避免杂质干扰后续反应。
调试酶标仪至450nm波长，校准自动洗板机吸头高度，准备好无屑吸水纸、排枪等耗材。
二、加样与温育
设置空白孔、标准品孔、待测样本孔，标准品按说明书梯度稀释，每孔分别加入100μL对应液体，轻晃混匀后用封板膜密封。
将酶标板置于37℃恒温箱中，温育30分钟，让猪胰岛素与包被抗体充分结合。
三、第一次洗刷操作
弃去孔内所有液体，在吸水纸上初步拍干，每孔加入320μL优化后的工作洗涤液，静置浸泡60秒。
甩干液体后拍干，重复该循环4次，最后一次彻底拍干孔内残留液体。
四、酶促反应与二次温育
每孔加入100μL HRP标记的酶标二抗，空白孔除外，再次用封板膜密封酶标板。
37℃恒温箱中继续温育30分钟，让酶标抗体与结合在板上的猪胰岛素充分反应。
五、第二次洗刷操作
弃去孔内全部反应液，重复上述“加洗涤液-浸泡-弃液-拍干”流程，完整洗刷5次，彻底洗脱未结合的游离酶标物。
最后一次洗刷完成后，用干净滤纸擦拭板底外侧残留液体，避免后续读数出现光斑干扰。
六、显色与终止读数
每孔先后加入底物A、底物B各50μL，轻晃混匀后37℃避光显色15分钟。
每孔加入50μL终止液，轻轻晃动混匀，10分钟内用酶标仪在450nm波长下读取各孔OD值。
七、结果计算
以标准品浓度为横坐标，对应OD值为纵坐标，绘制标准曲线，代入待测样本OD值，乘以对应稀释倍数，得到样本中猪胰岛素的实际浓度。
一、实验前准备
提前30分钟将试剂盒从2~8℃冰箱取出，所有试剂平衡至室温，确认浓缩洗涤液无结晶析出，按标准配方配制好1×工作洗涤液。
猪血清样本提前3000rpm离心15分钟，去除乳糜微粒与纤维蛋白沉淀，避免杂质干扰后续反应。
调试酶标仪至450nm波长，校准自动洗板机吸头高度，准备好无屑吸水纸、排枪等耗材。
二、加样与温育
设置空白孔、标准品孔、待测样本孔，标准品按说明书梯度稀释，每孔分别加入100μL对应液体，轻晃混匀后用封板膜密封。
将酶标板置于37℃恒温箱中，温育30分钟，让猪胰岛素与包被抗体充分结合。
三、第一次洗刷操作
弃去孔内所有液体，在吸水纸上初步拍干，每孔加入320μL优化后的工作洗涤液，静置浸泡60秒。
甩干液体后拍干，重复该循环4次，最后一次彻底拍干孔内残留液体。
四、酶促反应与二次温育
每孔加入100μL HRP标记的酶标二抗，空白孔除外，再次用封板膜密封酶标板。
37℃恒温箱中继续温育30分钟，让酶标抗体与结合在板上的猪胰岛素充分反应。
五、第二次洗刷操作
弃去孔内全部反应液，重复上述“加洗涤液-浸泡-弃液-拍干”流程，完整洗刷5次，彻底洗脱未结合的游离酶标物。
最后一次洗刷完成后，用干净滤纸擦拭板底外侧残留液体，避免后续读数出现光斑干扰。
六、显色与终止读数
每孔先后加入底物A、底物B各50μL，轻晃混匀后37℃避光显色15分钟。
每孔加入50μL终止液，轻轻晃动混匀，10分钟内用酶标仪在450nm波长下读取各孔OD值。
七、结果计算
以标准品浓度为横坐标，对应OD值为纵坐标，绘制标准曲线，代入待测样本OD值，乘以对应稀释倍数，得到样本中猪胰岛素的实际浓度。
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