摘要：尿白蛋白/肌酐比值（UACR）可消除尿液浓缩稀释干扰，是小鼠肾损伤、糖尿病肾病、药物肾毒性研究中无创监测肾功能的常用指标。本文基于Albuwell M竞争性ELISA与改良Jaffe法的商业化检测方案，详细讲解样本采集处理、实验操作、结果换算的全流程要点，同时解析UACR数据的局限性与干扰因素，提示需结合多维度指标综合评估肾功能。

关键词：UACR、尿白蛋白肌酐比值、小鼠肾功能检测、尿白蛋白检测、尿肌酐检测、糖尿病肾病、肾损伤、Jaffe 法、Albuwell M检测、药物肾毒性

一、为什么小鼠肾功能研究会关注UACR？
在小鼠肾损伤、糖尿病肾病、药物肾毒性及遗传性肾病研究中，尿液检测具备无创、可纵向追踪同一动物的优势，能够动态观察肾脏滤过屏障功能、蛋白排泄水平及干预措施的效果。尿白蛋白升高通常提示肾小球滤过屏障的选择性下降，是评估肾功能变化与模型表型的核心指标之一。

但尿液并非浓度恒定的体液体系：动物饮水量、排尿量、采样时段、采样方式（代谢笼/点尿）等因素，都会对尿液的浓缩稀释程度影响较大，进而改变分析物的实际浓度。仅检测尿白蛋白的绝对浓度，无法区分“肾脏损伤导致的蛋白排泄增加”与“尿液浓缩带来的浓度升高”。

尿白蛋白/肌酐比值（urinaryalbumin-to-creatinineratio,UACR，也简称ACR）通过同步检测同一份样本中的尿白蛋白与尿肌酐，以肌酐为内参校正尿液浓缩稀释的影响，反映单位肌酐背景下的白蛋白排泄水平，有效提升不同样本间的可比性。对于随机尿、点尿样本，这种归一化方式的价值更为突出。

二、UACR检测方法学原理
UACR由两项独立检测的结果换算而来，目前小鼠研究中普遍使用的商业化组合为Ethos Exocell的Albuwell M（尿白蛋白检测，货号1011）（点击查看） 与 Creatinine Companion（尿肌酐检测，货号1012）（点击查看），二者均为96孔板格式，可实现同批次样本的并行检测。

1.尿白蛋白检测：直接竞争性ELISA（Albuwell M）
尿白蛋白检测主要分为免疫化学法与体积排阻HPLC法，该试剂盒属于免疫化学法中的ELISA技术，是目前小鼠尿白蛋白检测较为常用的商业化方案之一。其采用直接竞争性抗体捕获ELISA原理，微孔板预包被小鼠白蛋白，所有试剂为即用型液体。

• 反应机制：向孔中加入样本与辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗小鼠白蛋白抗体后，液相中的样本白蛋白与固相包被的白蛋白竞争性结合酶标抗体。样本中白蛋白浓度越高，结合到固相的酶标抗体越少。
• 显色与定量：洗去未结合物质后，加入四甲基联苯胺（TMB）底物发生显色反应，硫酸终止后在450 nm波长下检测吸光度。吸光度值与液相中白蛋白浓度的对数成反比，采用半对数方式拟合标准曲线进行定量。
• 标准曲线范围：0.156~10 μg/mL（7个倍比稀释浓度点）。

方法特点：对小鼠白蛋白高度特异性，操作简便；洗板可使用自来水，条件不满足时也可使用专用TEA洗板缓冲液。

图1.Albuwell M (Mouse Albumin ELISA)检测试剂盒，货号1011

• 反应机制：碱性条件下，肌酐与苦味酸反应生成有色复合物；加入酸试剂后，该复合物特异性分解，而非肌酐色原的显色不受影响。通过计算加酸前后的吸光度差值，可特异性反映肌酐浓度。
• 标准品设置：包含1、3、10mg/dL三个浓度的肌酐标准品，检测线性范围为1\10mg/dL（即10\100μg/mL）。

图2. The Creatinine Companion检测试剂盒，货号1012

三、尿液中白蛋白和肌酐检测的完整实验操作流程
1.样本采集与保存
（1）采样方式

• 24小时尿样：使用代谢笼收集，可完整记录总排泄量，结果相对准确，但操作相对复杂。
• 随机尿/点尿样：可通过腹部按摩、将小鼠放置于96孔板上方等方式采集，操作简便但受浓缩稀释影响大，必须结合肌酐校正。
• 采样时需严格避免食物、粪便污染；血尿、精液污染的样本不可使用——血液中白蛋白浓度约为正常尿液的2000倍，会导致结果严重偏高。

• 样本采集后不加防腐剂，必要时通过离心澄清样本。
• 短期保存：4℃条件下可存放至多1周。
• 长期保存：-60℃条件下可存放至多2个月；解冻需室温自然进行，禁止加热解冻。
• 检测前将样本恢复至室温，充分混匀。

1. 试剂准备：所有试剂与样本提前平衡至室温。

2. 标准品稀释：用NHEBSA稀释液对MSA标准品进行7次1:2倍比稀释，得到0.156、0.313、0.625、1.25、2.5、5、10μg/mL的标准系列。

3. 尿液样本稀释：

   • 常规推荐1:21稀释（10μL样本+200μL稀释液）。

   • 初次开展实验时，建议设置原液、1:21、1:81三个稀释度，确定落在标准曲线线性范围内的稀释比例。

   • 每份样本更换全新吸头，避免交叉污染。

4. 加样与孵育：

   • 设置阴性对照、阳性对照，标准品做复孔，样本建议做复孔。

   • 除阴性对照孔外，每孔加入酶标抗体，封板后室温孵育30分钟。

5. 洗板与显色：

   • 洗板共10个循环，可使用自来水或洗板缓冲液。

   • 加入TMB显色液，室温显色5~10分钟；加入终止液后，以阴性对照孔为空白，在450nm处读取吸光度。

6. 结果计算：

   • 以log₁₀（白蛋白浓度）为横轴，平均吸光度为纵轴，进行半对数线性拟合。

   • 将样本吸光度代入公式，取反对数得到稀释后浓度，乘以稀释倍数得到原始尿液白蛋白浓度。

图3. 尿白蛋白ELISA操作实验流程

1. 试剂准备：检测前将0.5 MNaOH与苦味酸试剂按比例混合，配制碱性苦味酸工作液，现配现用。

2. 样本稀释：推荐用蒸馏水做1:20稀释，根据样本实际浓度调整稀释比例，确保结果落在线性范围内。

3. 加样与反应：

   • 设置空白孔、三个浓度标准品复孔、样本复孔，每孔加入20μL标准品/样本。

   • 每孔加入100μL碱性苦味酸工作液，室温静置10分钟后，在波长下读取初次吸光度。

   • 每孔加入100μL酸试剂，室温静置5分钟后，在相同波长下读取第二次吸光度。

4. 结果计算：

   • 计算每孔的吸光度差值ΔAbs=初次吸光度（碱性条件）-第二次吸光度（加酸后）。

   • 以肌酐浓度为横轴、ΔAbs为纵轴做线性回归，代入样本ΔAbs得到稀释后浓度，乘以稀释倍数得到原始尿液肌酐浓度。

图4. 尿肌酐ELISA操作实验流程

• 品系与个体差异：不同小鼠品系、性别、年龄、体重、肌肉量的尿肌酐排泄水平存在较为明显的差异，因此UACR更适用于同一模型体系内的组间比较、同组动物的纵向追踪，不适合跨品系、脱离模型背景的单纯数值比较。
• 与24h尿白蛋白的一致性：小鼠点尿UACR与24小时尿白蛋白排泄量并非完全一致，这种差异与肌酐排泄的品系特异性相关。因此，糖尿病并发症动物模型联盟（AMDCC）推荐同时报告24小时尿白蛋白排泄量与UACR两项指标。
• 干扰因素：尿路感染、明显高血糖、严重高血压、充血性心力衰竭等病理状态，以及运动、水负荷、采样体位等生理因素，均会影响尿白蛋白与肌酐的排泄，解读结果时需充分考虑这些混杂因素。
• 方法学固有局限：尿白蛋白ELISA不可使用含叠氮化钠的样本，HRP抑制剂会干扰显色结果；严重微生物污染的样本也会影响检测准确性。

• 尿白蛋白绝对浓度、24小时尿白蛋白排泄总量
• 肾小球滤过率（GFR）：优先选择菊粉清除、FITC-司替星经皮检测、碘海醇清除等方法；肌酐清除率因肾小管分泌肌酐的影响（部分品系肾小管分泌肌酐占比可达50%），会明显高估GFR，不推荐作为金标准。
• 肾组织病理：系膜基质扩张、肾小球基底膜厚度、足细胞数量、肾小管间质纤维化等形态学指标
• 肾小管损伤标志物、炎症与纤维化分子标志物、整体代谢表型