关键词：贴壁细胞转染、悬浮细胞转染、PEI转染试剂、细胞转染、293T细胞、Expi293F、CHO-S、瞬时转染、蛋白表达、抗体生产

摘要：本文结合293T、Expi293F、CHO-S三类细胞的生长与表达特性，分别制定贴壁、悬浮体系的PEI瞬转标准化操作流程，明确接种密度、复合物制备等核心参数；同时从温度调整、分批补料、收获窗口期三方面给出转染后培养优化方案，汇总转染效率偏低、细胞大量死亡、表达量不足、放大产量下降四类常见问题的解决路径，为重组蛋白与抗体的小试到中规模制备提供全流程参考。

三类主流表达细胞系的PEI瞬时转染与蛋白产量提升方案
本文针对293T、Expi293F、CHO-S三类主流表达细胞系，提供 PEI转染试剂 瞬时转染的标准化操作流程，梳理转染后培养条件优化与收获时机选择方案，汇总常见问题的排查思路与解决方法，为重组蛋白与抗体表达实验提供实操参考。

一、三类宿主细胞的转染特性与适配方向
不同细胞系在生长特性、核酸摄取能力、蛋白表达能力上存在差异，对应的PEI转染方案需针对性调整：

• HEK293T为贴壁细胞，转染耐受度高、表达速度快，适合小规模蛋白快速表达与功能验证；
• Expi293F为悬浮驯化的293细胞，细胞密度高、表达量大，适合中大规模重组蛋白与抗体的瞬转生产；
• CHO-S为悬浮中国仓鼠卵巢细胞，蛋白翻译后修饰更接近天然抗体，是抗体药物表达的常用宿主，但其转染难度略高于293系列细胞，需更精细的参数优化。

二、分细胞系标准化转染操作流程
1. HEK293T贴壁细胞转染流程（6孔板规模）
该流程适用于重组蛋白、抗体的小规模快速表达验证。

1. 转染前1天接种：按每孔2×10⁵细胞的密度接种至6孔板，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养；
2. 转染当天准备：确认细胞汇合度达到70%-80%，更换为低血清培养基（血清占比＜5%），每孔培养基总体积2mL；
3. 复合物制备：取1μg质粒DNA用100μLOpti-MEM稀释混匀；另取对应比例的PEI工作液用100μLOpti-MEM稀释混匀；将PEI稀释液缓慢加入DNA稀释液中，轻柔混匀后室温孵育15分钟；
4. 加样培养：将复合物逐滴加入细胞孔中，轻轻晃动培养板使其均匀分布，放回培养箱继续培养；
5. 转染后处理：转染后18-24小时更换为完全培养基；若细胞对低血清耐受度好，也可选择不换液。

图1.贴壁细胞HEK293 PEI转染实验流程

2.Expi293F悬浮细胞转染流程（500mL摇瓶规模）
适用于重组蛋白、抗体的中规模制备。

1. 转染前1天接种：按0.8×10⁶ cells/mL的密度接种细胞，置于37℃、120rpm、5%CO₂摇床中培养；
2. 转染当天确认状态：细胞密度达到1.8-2.2×10⁶cells/mL，细胞活力不低于98%；
3. 复合物制备：取150μg质粒DNA（抗体表达常用重链：轻链=1:1）用5mLOpti-MEM稀释；取对应量PEIMAX用5mLOpti-MEM稀释；将PEI稀释液滴加入DNA稀释液，混匀后室温孵育15分钟；
4. 加样与补料：将复合物加入摇瓶中，轻轻混匀后放回摇床；转染后24小时，补加10%-20%体积的新鲜表达培养基与对应补料。

1. 转染前1天接种：按1.0×10⁶cells/mL的密度接种细胞，37℃、120rpm、5%CO₂摇床培养；
2. 转染当天确认状态：细胞密度达到2.5-3.0×10⁶ cells/mL，活力不低于95%；
3. 复合物制备：取200μg质粒DNA（抗体表达常用重链：轻链=2:3）用5mLOpti-MEM稀释；取对应量PEIMAX用5mLOpti-MEM稀释；同上述方法制备复合物；
4. 转染后培养：复合物加入摇瓶混匀后继续培养；转染后24小时将培养温度降至31℃，同时补加新鲜培养基与对应添加剂；转染后48小时进行第二次补料。

图2.悬浮细胞PEI转染流程

三、转染后培养优化与收获时机选择
转染后的培养条件直接影响蛋白积累量与活性，需从温度、补料、收获时间三个维度优化。

1.温度控制
常规培养条件为37℃、5%CO₂、饱和湿度。对于CHO-S细胞的抗体表达，转染后24小时降温至31℃培养，可降低细胞代谢速率，延长存活周期，提升抗体整体产量。

2.补料与换液

• 贴壁293T细胞可通过换液更新营养，耐受度好的细胞也可维持原培养体系；
• 悬浮细胞体系通常采用补料策略，转染后24小时、48小时分批次补加新鲜培养基或专用补料，维持细胞营养供给，延长表达时间。

• 293T细胞：胞内蛋白通常48-72小时达峰，分泌型蛋白与抗体72-96小时达峰；
• Expi293F细胞：胞内蛋白72-96小时达峰，分泌蛋白与抗体96-120小时达峰；
• CHO-S细胞：整体表达周期更长，抗体通常在120-168小时达到峰值。

收获过早蛋白积累不足，收获过晚则易被细胞分泌的蛋白酶降解。建议设置时间梯度，确定目标蛋白的合适收获时间。

四、常见转染问题的排查与解决
1.转染效率偏低
常见原因包括细胞状态差、质粒质量不合格、N/P比例不合适、复合物制备操作有误、稀释液成分不适配。

对应解决方向：更换低代次、高活力细胞；重新提取去内毒素质粒；优化DNA与PEI的配比；严格执行PEI加入DNA的操作顺序；更换为Opti-MEM等合规稀释液。

2.转染后细胞大量死亡
通常由DNA/PEI用量过高、复合物孵育时间过长、转染后未及时换液导致。
可通过降低核酸或PEI用量、缩短复合物孵育时间、转染后4-6小时更换新鲜培养基等方式改善。

3.转染效率达标但蛋白表达量低
可能原因包括表达载体元件不合适、收获时间过早、培养条件不佳、蛋白发生降解。
可优化启动子、信号肽等载体元件；延后收获时间匹配表达峰值；调整温度与补料策略；必要时在培养基中添加蛋白酶抑制剂。

4.小试效果稳定，放大后产量下降
多由混合均匀度不足、摇瓶参数不匹配、细胞密度控制偏差导致。

放大生产时可采用磁力搅拌缓慢混匀复合物；优化摇瓶转速与装液量；保持与小试一致的转染细胞密度，降低规模效应带来的波动。

综上，PEI瞬时转染是重组蛋白、抗体及病毒载体研发中核心的核酸递送手段，其效率与稳定性由细胞状态、核酸品质、参数配比与操作细节共同决定。实验优化需从底层逻辑出发：细胞层面严格把控传代次数、生长阶段与活力水平，建立规范的种子库与污染防控机制；核酸层面保障质粒纯度与低内毒素水平，匹配合适用量与比例；通过梯度优化确定适配的N/P配比，同时规范复合物制备的稀释体系、加样顺序与孵育时长。唯有系统化控制变量、标准化操作流程，才能构建稳定可重复的转染体系，为生物制药与基础科研的体外表达实验提供可靠支撑。

目前市售 PEI转染试剂 覆盖不同分子量与剂型，其中Polysciences旗下的25 kDa线性PEI、40kDa PEI MAX等产品，适配上述三类细胞的转染需求。

本文基于Polysciences公开资料由其中国提供商上海曼博生物整理，用于科研信息分享、实验参考等，具体参数需结合实验体系与蛋白特性进一步优化。上海曼博生物可提供Polysciences 25 kDa线性PEI、40kDa PEI MAX及293T、Expi293F、CHO-S细胞瞬时转染相关PEI转染试剂产品。