英文标题：Iron-mediated ferroptosis impairs CAR-T cell function and antitumor efficacy

中文标题：铁介导铁死亡损伤 CAR-T 细胞功能与抗肿瘤疗效

研究依托多发性骨髓瘤、急性淋巴细胞白血病临床 CAR-T 队列样本、体外 CAR-T 培养体系、多种血液肿瘤异种移植小鼠模型完成机制与疗效验证。

纳入复发难治多发性骨髓瘤、急性淋巴细胞白血病 CAR-T 治疗患者外周血样本，分扩增、衰退两个时间点检测；单细胞转录组 ssGSEA 分析显示衰退期 CAR-T 铁死亡通路评分显著上调，流式验证胞内游离铁、脂质 ROS 蓄积，WB 检出 4-HNE、ACSL4 铁死亡标志物升高，血清铁、铁蛋白基线水平更高的患者临床应答更差，初步建立铁过载、铁死亡与 CAR-T 疗效负相关的临床关联。

体外添加生理浓度柠檬酸铁模拟患者体内血清铁环境，梯度铁处理后 CAR-T 活力下降、线粒体结构破损、氧化磷酸化受损；流式检测记忆 Tcm 比例下调、PD1/TIM3/LAG3 耗竭分子升高，细胞毒实验证实铁暴露显著抑制 CAR-T 杀伤能力；126 种小分子筛选发现 Fer-1 为最优铁死亡抑制剂，可逆转铁诱导的 CAR-T 功能损伤，为体内干预提供候选药物。

CRISPR 构建 ACSL4 敲除 CAR-T 细胞，脂质组学证明 ACSL4 缺失阻断铁诱导多不饱和脂质过氧化产物累积；铁刺激下 ACSL4 磷酸化水平上升，上调促氧化脂质池，驱动线粒体 ROS 爆发；敲除 ACSL 可完全逆转铁过载带来的 CAR-T 耗竭、活力下降，明确 ACSL4 为铁死亡关键脂质代谢靶点。

采集 CRS 模型小鼠外周血清、体外 CAR-T 共培养上清为检测样本，采用 Luminex 悬浮芯片平台并行定量多重免疫细胞因子；样本离心去杂质后标准化蛋白归一，荧光编码抗体微球同步捕获靶标，孵育洗涤后荧光仪读取信号，标准曲线换算各因子绝对浓度，组间差异统计学分析，配套单因子 ELISA 交叉验证结果。

 

同步定量 IL-2、IFNγ、TNFα、IL-6、IL-1β、IL-10、IL-8、MCP-1、IL-12p40、ICAM-1 等十余种效应 / 炎症 / 趋化因子，覆盖 CAR-T 活化、抗肿瘤效应、CRS 相关核心标志物。

 

1）铁暴露野生型 CAR-T 组：Luminex 结果显示 IFNγ、IL-2、TNFα 等抗肿瘤效应因子分泌显著下调，促炎损伤因子 IL-6、IL-8 上升，提示铁死亡破坏 CAR-T 正常细胞因子分泌谱；

2）Fer-1 抑制剂预处理组：效应因子水平显著回升，促炎因子回落，证明铁死亡抑制可恢复 CAR-T 免疫分泌功能；

3）ACSL4 敲除 CAR-T 组：Luminex 多因子谱与 Fer-1 干预组趋势高度一致，且不会造成过量炎症因子释放，说明 ACSL4 基因编辑可在提升抗肿瘤因子同时规避严重 CRS 风险；

4) 动物体内血清 Luminex 数据：ACSL4-KO CAR-T 回输小鼠体内无细胞因子风暴，兼顾抗肿瘤活性与治疗安全性，为基因编辑 CAR-T 临床转化提供分泌组层面直接证据。

 

 

相比单指标 ELISA，Luminex 微量样本即可一次性完成多因子并行定量，可同步评估 CAR-T 抗肿瘤能力与 CRS 炎症风险，适配细胞免疫治疗分泌组全景机制解析。

构建 Nalm6 淋巴瘤、143B 骨肉瘤 NSG 异种移植模型，分为未修饰 CAR-T、Fer-1 预处理 CAR-T、ACSL4 敲除 CAR-T 三组；活体荧光成像、生存期统计显示，ACSL4-KO CAR-T 组肿瘤负荷最低、小鼠生存期最长；骨髓流式证实该组 CAR-T 体内存续时间更长、耗竭比例更低，同时脏器病理无明显毒副反应，验证靶向 ACSL4 抑制铁死亡可长效提升 CAR-T 体内抗肿瘤作用。

该研究明确临床输注后血清铁蓄积通过 ACSL4 介导脂质过氧化触发 CAR-T 铁死亡，造成细胞耗竭、效应因子分泌受损；借助 Luminex 多因子定量直观证明铁死亡抑制剂或 ACSL4 基因编辑可重塑 CAR-T 细胞因子分泌图谱，兼顾抗肿瘤效力与 CRS 安全性，提出靶向铁代谢 - 铁死亡通路是优化 CAR-T 持久性、改善血液肿瘤临床疗效的全新转化策略。

本研究血清 / 细胞上清多因子检测采用 Luminex MAGPIX 悬浮芯片体系，全部实验流程可由乐备实（LabEx，优宁维蛋白检测平台）标准化承接，可同步实现效应因子、炎症因子、趋化因子高通量同步定量，微量样本、高通量特性完全适配 CAR-T 细胞免疫、CRS 机制类研究。

乐备实拥有标准化 Luminex 专属实验室，全自动孵育、荧光扫描系统，批内 / 批间 CV 严格质控；支持细胞上清、动物血清、组织匀浆多类型样本一站式前处理与检测，在 CAR-T、免疫细胞代谢、铁死亡、细胞因子释放综合征相关高分课题拥有大量成熟项目案例，可提供 Luminex 多因子全景初筛 + 单因子精准验证一体化实验方案，与本文分泌组研究逻辑高度契合。

乐备实（上海优宁维生物科技股份有限公司旗下全资子公司），是国内专注于提供高质量蛋白检测以及组学分析服务的实验服务，自2018年成立以来，乐备实不断寻求突破，公司的服务技术平台已扩展到超敏电化学发光、Luminex多因子检测、抗体芯片、ELISA、单细胞测序、DSP空间多组学、流式检测、Elispot、PLA空间蛋白互作等30多个技术平台，建立起了一套涵盖蛋白、细胞以及组织水平实验的完整检测体系。