超分辨荧光显微成像技术能够突破光学衍射极限，在纳米尺度上揭示生物分子的空间分布与亚细胞超微结构，为神经科学与生命科学研究提供了前所未有的分辨能力。该技术在解析突触蛋白组织、细胞器架构及神经环路连接等方面具有不可替代的核心应用价值。

现有主流超分辨手段包括受激发射损耗（STED）显微镜、最小光子通量（MINFLUX）纳米镜和单分子切换纳米镜（SMSN），分别通过不同物理机制将分辨率提升至数十纳米量级，已在分离培养的神经元中揭示了突触前后蛋白的空间排布规律。然而，这些研究多基于稀疏二维的神经元培养体系，无法还原脑组织中树突、轴突与每神经元多达上万个突触紧密交织的三维致密环境；传统三维超分辨显微在 50 微米或更厚的脑切片中轴向分辨率仅为 85 至 120 纳米，存在显著的各向异性，难以解析 15 至 60 纳米尺度的突触蛋白复合物。

脊柱形态学分析演示

4Pi-BRAINSPOT 概念与演示概述

4Pi 单分子切换纳米镜（4Pi-SMSN）通过两个对置物镜相干探测单分子发射光子，可在三个维度上实现亚 10 纳米的定位精度，为各向同性超分辨成像提供了可行路径。然而，将 4Pi-SMSN 应用于脑组织面临多重工程瓶颈：生物组织的复杂光学特性引发散射和像差，破坏干涉发射图案的完整性；温度波动导致相干腔相位漂移与物镜失准，进一步降低干涉对比度；长时间采集过程中的系统时变像差使传统体外校准的点扩散函数（PSF）模型与实际数据严重失配。

4Pi-BRAINSPOT在转基因小鼠脑切片中的应用演示

研究团队开发了面向脑组织的4Pi 单分子纳米镜 ——4Pi-BRAINSPOT，将 4Pi-SMSN 与动态原位相干 PSF 检索算法（4Pi-INSPR）、SMSN 兼容组织透明化及高倾角层状光片（HILO）照明协同集成。该方案在 50 微米小鼠脑切片中实现了 6.4±0.4 纳米的横向定位精度和 2.9±0.4 纳米的轴向定位精度，整体三维分辨率优于 15 纳米；快速光学透明化（FOCM）使相干条纹对比度从 0.25±0.07 提升至 0.38±0.04（1.5 倍），信号背景比从 80.1±6.0 提升至 106.9±14.7（1.3 倍）；HILO 照明使离焦背景降低 60%。

该成果发表于《Nature Communications》：Interferometric ultra-high resolution 3D imaging through brain sections。

4Pi-INSPR 算法从采集的 4 通道单分子闪烁数据中分割个体干涉发射图案以构建原位 PSF 库，通过相干 4Pi 相位检索迭代提取两个物镜的光瞳函数，从而捕获由仪器缺陷和生物样本共同引入的相干像差；动态模型更新按时间窗口修正物镜 XYZ 方向失准和腔相位偏移，生成时变响应函数。例如，在含 11 种 Zernike 像差的模拟中，该算法对 ±800 纳米轴向范围内图案的检索归一化互相关相似度达 0.98±0.05，物镜横向与轴向失准检索标准差分别为 4.4 纳米和 1.4 纳米，腔相位差检索标准差为 12.7 毫弧度；在 COS-7 细胞中对 α- 微管蛋白成像获得 9.9±2.7 纳米横向与 5.5±2.0 纳米轴向分辨率，可清晰分辨直径 50 至 70 纳米微管的中空环形截面；对线粒体外膜蛋白 TOM20 成像获得 6 至 10 纳米的膜截面半高宽；对内质网塑形蛋白 Rtn4 成像可区分半径约 30 纳米的环形小管与间距 100 纳米的平行双线两种内质网管腔形态。

4Pi-BRAINSPOT 在哺乳动物细胞中的性能

4Pi-BRAINSPOT 将干涉单分子纳米镜、原位 PSF 检索、FOCM 组织透明化与 HILO 照明集成为完整的深层组织分子成像平台，并配套开发了基于 alpha-shape 算法的树突棘三维形态定量分析流程。研究团队在 50 微米厚的转基因小鼠脑切片中对光敏感通道蛋白 ChR2-EYFP 进行成像，在视皮层完整神经环路环境下重建了单个树突棘从母干经棘颈到棘头的三维膜轮廓：单分子簇横向尺寸为 13.0±2.2 纳米、轴向为 6.8±1.3 纳米，神经元膜截面半高宽约 8 纳米；定量分析覆盖长度 0.6 至 2.4 微米的多种棘型，棘颈半径范围为 34.1 至 159.7 纳米（均值 81.1±33.6 纳米），棘头半径为 104.3 至 353.3 纳米（均值 193.1±59.3 纳米），总体积 0.02 至 0.36 立方微米。在视觉经验可塑性实验中，被动视觉训练后树突棘长度从 1.3±0.1 微米增至 1.5±0.1 微米，体积从 6.9±0.9×10⁷立方纳米增至 10.7±1.8×10⁷立方纳米，棘头最大面积增大而棘颈最小面积减小，膜表面分子定位密度从 5.2±0.3×10³ 微米⁻² 升至 6.4±0.5×10³ 微米⁻²，一致指向经验依赖的突触结构成熟化趋势。

有无视觉经验时树突棘形态的对比

4Pi-BRAINSPOT 首次在完整脑组织中实现了亚 15 纳米各向同性三维超分辨成像，为在原生神经环路环境下解析突触超微结构与分子分布提供了关键技术手段。研究团队下一步将拓展多色标记与活体成像能力，并推动该技术在神经发育障碍与神经退行性疾病病理机制研究中的应用，有望从分子尺度揭示脑疾病的结构基础。

论文信息
声明：本文仅用作学术目的。
Gao, HC., Xu, F., Cheng, X. et al. Interferometric ultra-high resolution 3D imaging through brain sections. Nat Commun 17, 5550 (2026). 

DOI:https://doi.org/10.1038/s41467-026-71614-6