实验目的：获取活单细胞
1、组织解离后进行流式检测、细胞分选或单细胞转录组测序。
2、把病人的肿瘤解离成活细胞后，做3D类器官培养（PDO）或者给小鼠PDX荷瘤建模。

需要试剂、耗材等：
必选：解离液、无菌PBS、胶原酶混合物、DNaseI、完全培养基
可选：红细胞裂解液、组织保存液
Or直接买组织解离试剂盒Dissociation Kit （省心！）­
70 μm细胞滤网、眼科剪、镊子、无菌培养皿及离心管、巴氏吸管、冷冻离心机，
及显微镜、细胞计数仪、生物安全柜/超净台。

含半自动化标准化进阶方案（单样本仅需3 min），文末附不同类型组织解离保姆级教程。

方案一：手动解离：
组织离体剪碎 (＜1 mm³) ──> 37°C酶法摇床消化 (15-60 min) ──>终止消化+70 μm滤网过滤 ──> 300-500×g低速离心收集细胞沉淀 ──> 活细胞率计数 ──> 下游检测or建模

步骤1：样本离体与剪碎（前置重要的一步）
· 组织离体后，必须放置在含有双抗/三抗的4°C组织保存液中。严禁冰冻，必须在 2-4 h内开始处理，否则时间越长细胞死亡率越高。
· 将组织转移至无菌培养皿中，用预冷的PBS洗涤2-3 次，洗净表面的血块、脂肪、结缔组织及坏死区域；用眼科剪和镊子将坏死发黑区域剔除。
· 在无菌培养皿中保留少量液体（6 cm皿需1-2 mL，防止组织干涸）。用眼科剪将组织剪碎成1 mm³的碎片。

目的：物理剪碎越充分，组织与解离酶接触比表面积越大，能显著缩短后续37°C消化时间，降低样本损失。

­P.S. 如果只需要提取全蛋白进行WB无需提取活细胞：将组织（绿豆大小）+500 μL RIPA裂解液+3个2 mm磁珠放入1.5mL Ep管，管子放入研磨仪冰冻模块，研磨5-10 min后，吸取液体加入Loading Buffer，高温煮沸变性跑胶即可。

步骤2：37°C酶法解离
· 用无菌吸管将剪碎的组织悬液吸入15 mL或50 mL离心管中，加入预热好的胶原酶工作液（通常为组织体积的5-10倍，如0.1 g-0.5 g（约1个黄豆大小）的组织需加2-3 mL胶原酶）。 建议在胶原酶工作液中添加20-100 μg/mL DNase I，用于降解死细胞释放的粘稠 DNA，预防细胞抱团拉丝、堵塞滤网。
· 将离心管放入37°C恒温水浴摇床中进行温和振荡消化（转速建议控制在100-150 rpm；若放普通培养箱，需每隔5-10 min拿出来温和颠倒混匀数次）。
· 根据组织不同，通常消化15-60 min。每隔15 min用吸管吸取少量悬液，在倒置显微镜下观察——若大块组织浑浊散开，视野中出现大量折光性圆润的游离单细胞或微小细胞团，即代表消化达到终点。切忌过度消化！

步骤3：终止消化与细胞过滤
· 向消化液中加入等体积或2倍体积的含10% FBS的完全培养基（利用血清中的蛋白竞争性抑制蛋白酶活性），或试剂盒里的专用终止消化缓冲液。
· 用吸管轻柔上下吹打悬液5-10次，帮助残留的松散小细胞团释放为单细胞（注意避免过猛产生大量气泡）。
· 将无菌70 μm细胞滤网架在新的无菌50 mL离心管上，悬液缓慢滴加过筛，去除残渣和沉淀。

步骤4：离心与红细胞去除
· 将过滤后的单细胞悬液300-500×g 4°C离心5 min，弃除上清（注意此时沉淀即为获得的细胞；上清为含有解离酶和死细胞碎片的废液）。
· （可选）去除红细胞：若管底沉淀明显发红，弃上清后每管加入1-2 mL预冷的红细胞裂解液，轻柔重悬后在冰上静置2-3 min；随后立刻补加10 mL冷PBS终止裂解，再次300-500×g离心5 min洗净。
· 再次用PBS洗涤细胞沉淀1次，低速离心彻底去除残留的酶和毒性产物。

步骤5：重悬计数
· 用适量的特化原代培养基（如类器官培养基、免疫细胞无血清完培等）轻柔重悬最终的单细胞沉淀。
· 取10 μL细胞悬液与等体积台盼蓝（Trypan Blue） 混合，用血球计数板或自动计数仪检测计数活细胞数与活细胞率（Viability）。
· 合格线：解离后的活细胞率须严格保持在> 80%，且无明显细胞团块聚集。

⚠️如果你害怕手动解离有如下问题：
处理的是感染性样本，
无菌操作不当产生交叉污染，
样本珍贵摸不准条件怕解离过头，
手动解离总是消化过头、死细胞太多，
每次样本的匀浆效果不一致、结果不稳定，
或者，
只是单纯地想节省时间……

封闭系统、3 min处理1-2个样本、标准化程序，gentleMACS自动化解离将是你的不二之选

注：
· 人工操作时长指实验人员需亲手操作、全程值守的时间，包含组织剪碎、研磨、间断吹打、照看样本等环节；
· 自动化解离仅需样本前处理装样、终末收样两步人工操作，中间酶孵育、解离程序运行全程无人值守，实验人员可同步开展其他实验。

半自动化方案（gentleMACS）所需套装：

	名称
	gentleMACS™ Dissociator
	gentleMACS 25 C Tubes
	Tissue Dissociation Kit

Miltenyi gentleMACS™ Dissociator
· 中国食品药品检定研究院、北京大学医学部、吉林大学等机构均采购 gentleMACS™ Octo 型号，用于疫苗研发、药物筛选等国家级项目。
· 全球超 2000 篇科研论文引用 gentleMACS™技术，覆盖《Nature》《Science》等顶级期刊。

方案二：半自动化方案（gentleMACS） ：
1、组织预处理：去除组织包膜、血管等结缔组织，用PBS清洗后剪切成2 mm的小块（与手动解离一样）。
2、体系配制：将组织块与预热好的专用解离酶液一同加入无菌C型解离管中，拧紧管盖。
3、自动化解离：根据组织类型选择对应的预设程序（覆盖肿瘤、脾脏、肝脏、脑组织等20余种常见样本），放入gentleMACS Dissociator仪器，一键解离，3 min左右即可完成解离。
4、解离结束后，将细胞悬液转移至离心管，后续过筛、离心、红细胞裂解、重悬计数步骤与手工法完全一致。

如果使用gentleMACS解离仪配套Kit，那么你将收获：
节省下的许多时间，重复性好的样本，更高的活细胞率……
你说“我要处理的样本很简单，就是过程中遇到点问题，来找找原因”？
没问题！接下来列举的4个【大坑】 90%的新老手都遇到过。

避坑指南：
📌 大坑一：活细胞率偏低（<70%），死细胞及毒素碎片特别多
❓ 为什么会这样：
· 组织离体太久缺氧坏死，或者保存运输条件不对。
· 实体瘤中心的黑色坏死核心没有提前剔除，死细胞毒素扩散。
· 酶消化太猛（水浴温度超过37°C、消化时间太长）。
· 手动剪碎组织的时候动作过于暴力，机械挤压导致细胞破裂。

💡 绝招怎么破：
· 控时保鲜：离体最好在2-4 h 内处理；异地寄送必须用4°C组织保存液（能强效保鲜48 h，严禁冰冻！）。
· 切除坏死：剪碎前先剪去肿瘤发黑、变糊的中央坏死核心。
· 温和消化：严格把控37°C温水浴，适度缩短消化时间。

📌 大坑二：细胞严重粘连结团，像胶水一样拉丝
❓ 为什么会这样：
· 最常见元凶：忘加DNase I（脱氧核糖核酸酶）！ 少数细胞破裂后释放的长链内源性DNA，会像蜘蛛网粘稠拉丝。
· 漏了细胞筛网过滤这道工序。

💡 绝招怎么破：
· 必加DNase I：在解离酶工作液和洗涤重悬液里，全程添加DNase I，直接把黏糊糊的DNA网消化融化掉！
· 千万别省过滤：无论如何都要过一遍40μm或70μm的细胞筛网，彻底去除黏液与细胞渣。

📌 大坑三：消化不彻底，流式仪堵针
❓ 为什么会这样：
· 组织剪得太大块，酶液渗透不进组织中心。
· 酶选错了。
· 没过筛网，大量多细胞小团块直接上机。

💡 绝招怎么破：
· 严格控制大小：消化前务必耐心用眼科剪把组织细细剪成1 mm³大小。
· 如何选用合适的胶原酶：
高胶原组织（肿瘤、皮肤、心脏）：需要胶原酶I 型/II型，主要破坏结缔组织。
富含基质膜与上皮组织（肺、肾、肠道）：偏向使用 胶原酶IV型（对基底膜极具破坏力）。
高脂高神经组织（脑、脂肪）：对机械损伤极度敏感，必须用最温和的木瓜蛋白酶（Papain）。
· 严格过筛：重悬上机前，必须过40 μm/70 μm筛网，把未消化透的残渣和团块彻底拦截，保护昂贵的芯片和流式探针。

📌 大坑四：细胞活着，但流式测不出目标标签（如CD4、CD8、CD31）
❓ 为什么会这样：
· 用了烈性的胰蛋白酶（Trypsin），胰酶没有识别特异性，不仅消化了外基质，还把活细胞膜表面的表型受体蛋白破坏了。
💡 绝招怎么破：
· 做表型和测序严禁使用胰酶！
· 推荐方案：强烈建议换用温和的“胶原酶（I / II / IV系列）+ 中性蛋白酶”组合。不仅能完美解开细胞间基质，还能完好保留细胞表面的“信号天线”。

🌟 最后重点提醒： 做活体细胞解离千万不可以用传统钢珠物理研磨仪哦！那个是专为提取全蛋白跑Western Blot或提核酸设计的暴力破壁工具，一旦研磨，活细胞率会直接清零！

不同类型组织解离、单细胞提取保姆级教程：
https://www.univ-bio.com/study-center/solution/Technology/SCS.html

包含小鼠、人源多种类型：

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