5-氮杂胞苷（5-Azacytidine, 5-azaC）是一种临床上广泛用于治疗高危骨髓增生异常综合征（MDS）和急性髓系白血病（AML）的去甲基化药物（HMA）。传统观点认为其作用机制是作为DNA去甲基化剂，但DNA去甲基化不能解释5-azaC处理后的差异表达基因模式。

2026年9月15日，芝加哥大学高博阳博士为第一作者，华人科学家、芝加哥大学何川教授和德克萨斯大学圣安东尼奥医学中心徐明江教授为共同通讯作者，在国际著名期刊《Molecular Cell》（IF16/Q1）发表题为“5-Azacytosine induces cytotoxicity via 5-methylcytosine depletion on chromatin-associated RNA in leukemia”的高水平科研成果。该研究颠覆了一个传统认知：5-azaC作为核糖核苷类似物，比DNA更易掺入新生RNA中，其在早期时间点（8-24小时）即可通过共价抑制RNA 5-甲基胞嘧啶（m5C）甲基转移酶（尤其是NSUN2），导致染色质相关RNA（caRNA）上的m5C甲基化耗竭，进而抑制转录、诱导白血病细胞凋亡。

标题：5-Azacytosine induces cytotoxicity via 5-methylcytosine depletion on chromatin-associated RNA in leukemia（5-氮杂胞苷通过耗竭染色质相关RNA 5-甲基胞嘧啶诱导白血病细胞毒性）
发表时间：2026-09-15
发表期刊：Molecular Cell
影响因子：IF16/Q1
技术平台：m5C MeRIP-seq、RNA-seq、CUT&Tag（易基因金牌技术）
作者单位：芝加哥大学、德克萨斯大学圣安东尼奥医学中心等
DOI:10.1016/j.molcel.2026.08.018

研究摘要
本研究证明了5-azaC处理所致的RNA m5C甲基化耗竭（尤其早期时间点），可以诱导白血病细胞凋亡。与其DNA去甲基化功能相反，5-azaC的RNA依赖性效应导致转录抑制，扰乱细胞周期调控和DNA修复相关基因表达，最终导致白血病细胞凋亡。
机制研究表明，5-azaC耗竭染色质相关RNA（caRNA）上的m5C，破坏了MBD6介导的H2AK119ub去泛素化过程；同时也破坏了SRSF2招募及其下游p300介导的H3K27ac沉积。caRNA甲基转移酶NSUN2缺失导致细胞周期延长、DNA修复缺失，并使造血谱系向红系分化偏移，其表型与5-azaC处理效果高度一致。本研究结果阐明了5-azaC通过耗竭caRNA m5C实现转录抑制，进而诱导白血病细胞凋亡，为深入理解5-azaC的作用机制提供了新见解。

研究亮点

• 5-azaC的RNA依赖性转录抑制诱导白血病细胞毒性
• 5-azaC耗竭caRNA上的m5C，破坏MBD6结合及H2AK119ub去泛素化
• 5-AzaC削弱SRSF2的染色质结合、p300招募及H3K27ac沉积
• TET2或IKZF1缺失可增强白血病细胞对5-azaC的敏感性

图形摘要

研究方法
5-azaC处理与时间点设计：3μM浓度处理白血病细胞系（MOLM13、SKM1、HEL、OCI-AML3、HL60、THP1等）及AML患者来源样本，重点分析8-24小时的早期时间点，以区分RNA依赖效应与DNA依赖效应。
多组学测序分析

• M5C MeRIP-seq：鉴定caRNA上的m5C修饰位点。
• CUT&Tag：检测组蛋白修饰（H2AK119ub、H3K27ac）及SRSF2的染色质结合变化。
• RNA-seq：检测基因表达变化。
• nascent RNA-seq：检测新生转录本，精确反映转录活性变化。
• CLIP-seq：验证5-azaC诱导的MBD6结合下降与m5C减少共存。

功能及验证实验

• UHPLC-MS/MS：定量检测caRNA、tRNA中m5C及基因组DNA中的5mC时序变化。
• Aza-IP检测5-azaC与NSUN2的共价交联
• TUNEL凋亡检测、EdU细胞周期分析、免疫荧光、邻近连接实验（PLA）

结果图形
（1）5-AzaC在早期时间点诱导RNA m5C甲基化耗竭、转录抑制和白血病细胞凋亡
研究人员通过EU掺入实验和nascent RNA-seq发现，5-azaC处理后8小时开始出现转录抑制，与caRNA m5C水平初始下降时间吻合。Aza-IP实验证实NSUN2与RNA交联在4小时仅轻微检出，8小时后达到峰值，且先于m5C甲基化耗竭和转录抑制，揭示5-azaC的时序动态作用。

图1. 5-azaC在早期时间点诱导RNA m5C耗竭、转录抑制和白血病细胞凋亡

（2）5-azaC的RNA依赖性效应诱导白血病细胞凋亡
与DNA去甲基化功能不同，5-azaC的RNA依赖性效应导致转录抑制，扰乱细胞周期调控和DNA修复相关基因表达。研究通过细胞周期、DNA修复活性检测等证实，RNA依赖性转录抑制破坏了细胞周期进程、削弱DNA损伤修复能力并促进凋亡，从而促进白血病细胞凋亡。

（3）5-AzaC通过m5C依赖性H2AK119ub调控诱导转录抑制
m5C MeRIP-seq绘制了5-azaC处理16h前后caRNA m5C的全转录组图谱。结果显示5-azaC处理16h后MOLM13细胞caRNA m5C显著降低（21,158个peak中7,095个下调），LTR是最主要被修饰的重复RNA类型。与研究团队先前揭示的m5C/MBD6/PR-DUB/H2AK119ub调控轴一致，5-azaC处理16h导致H2AK119ub整体升高（图2A）。H2AK119ub CUT&Tag显示，m5C修饰caRNA附近的基因组区域H2AK119ub水平升高（图2B-C），且LTR亚家族升高最显著（尤其在TSS区域）（图2D），在LK细胞中也观察到类似现象（图2E）。
MBD6 CLIP-seq显示5-azaC处理后MBD6在m5C降低位点结合下降（图2B），证实m5C缺失破坏MBD6招募。NSUN2敲低同样引起H2AK119ub上调（图2F），其他m5C甲基转移酶敲低无效；DNMT1敲低反而降低H2AK119ub，进一步证明早期效应受RNA m5C调控。MBD6敲低使MOLM13细胞对5-azaC增敏（图2G），提示5-azaC联合MBD6抑制剂可能是潜在治疗策略。

图2：5-azaC通过m5C依赖性H2AK119ub调控诱导转录抑制
A. MOLM13细胞经5-azaC处理16h后，H2AK119ub变化的免疫印迹。
B. IGV图谱展示MOLM13细胞经5-azaC处理16h后，TINAGL1位点的caRNA m5C MeRIP-seq、H2AK119ub CUT&Tag和MBD6 CLIP-seq信号。
C. MOLM13细胞经5-azaC处理后，m5C位点H2AK119ub水平变化Metaplot图和热图。
D. 各重复序列家族的H2AK119ub变化。
E. LK细胞经5-azaC处理后，已鉴定位点H2AK119ub水平变化的Metaplot图和热图。
F. MOLM13细胞经Dox诱导NSUN2沉默5天后，H2AK119ub变化的免疫印迹。
G. MOLM13细胞经48h shRNA介导的MBD6缺失后，再经5-azaC处理的细胞增殖。

（4）5-AzaC通过下调H3K27ac诱导转录抑制
5-azaC处理16h后，MOLM13、SKM1及患者来源的白血病细胞系中H3K27ac水平整体下降（图3A），且这种下降持续存在，与转录抑制主导效应一致。CUT&Tag证实H3K27ac全局下调，细胞周期和DNA修复基因影响尤为显著（图3B-C）。将邻近H3K27ac峰变化分为四个分位数（Q1代表下调最显著），与nascent RNA-seq比较显示H3K27ac丢失与下调基因的转录抑制相关（图3D）。NSUN2缺失或NSUN2抑制剂DO-268处理均导致H3K27ac降低（图3E-F），证实NSUN2催化活性的关键作用。

图3：5-azaC通过下调H3K27ac诱导转录抑制
A. SKM1细胞经5-azaC处理16h后H3K27ac变化的免疫印迹分析。
B. SKM1细胞经5-azaC处理16h后，注释基因H3K27ac变化的metaplot图和热图。
C. SKM1细胞中细胞周期和DNA修复基因集上H3K27ac变化的metaplot图。
D. SKM1细胞中，各组基因的H3K27ac变化（左图）和新生RNA-seq变化（右图）。
E-F. SKM1细胞经Dox诱导NSUN2敲低5天（E）或5μM DO-26B处理（F）后H3K27ac变化的免疫印迹分析。

（5）5-AzaC通过抑制SRSF2介导的p300招募下调H3K27ac
鉴于SRSF2是m5C结合蛋白且与染色质结合、调控转录，研究人员验证了其机制。结果显示，SRSF2敲低导致H3K27ac降低（图4A）。免疫荧光和邻近连接实验证实SRSF2与p300共定位及互作，支持SRSF2招募p300调控H3K27ac（图4B-D）。5-azaC处理后，SRSF2的RNA结合能力降低，导致其染色质结合减少。SRSF2 CUT&Tag显示其染色质结合显著减少，与H3K27ac下降相关（图4E、G）。NSUN2敲低同样减少SRSF2染色质结合（图4F-G）。上述研究结果表明，5-azaC通过m5C/SRSF2/p300/H3K27ac轴实现转录抑制，凸显RNA m5C在5-azaC表观遗传调控中的关键作用。

图4：5-azaC通过SRSF2介导的p300招募下调H3K27ac
A. SKM1细胞经48小时shRNA介导的SRSF2缺失后，H3K27ac变化的免疫印迹检测。
B. SKM1细胞中SRSF2与p300的共免疫荧光染色。
C. 沿（B）中黄色线条对SRSF2-p300共定位的定量分析。
D. SKM1细胞中SRSF2与p300的邻近连接实验（PLA）。
E. 5-azaC处理后，SRSF2靶位点处SRSF2和H3K27ac变化的Metaplot图和热图。
F. 5-azaC处理后，下调的SRSF2峰处SRSF2 CUT&Tag水平变化的Metaplot图和热图。
G. IGV图谱展示经5-azaC处理16小时或Dox诱导NSUN2缺失后，PEG10附近基因组位点的caRNA m5C MeRIP-seq、SRSF2 CUT&Tag和H3K27ac CUT&Tag信号。

（6）NSUN2调控白血病细胞增殖和造血谱系定向
作为5-azaC介导转录抑制的主要m5C甲基转移酶，NSUN2敲低可复现5-azaC的细胞毒性表型：抑制MOLM13细胞增殖、下调细胞周期基因、降低S期细胞比例、下调DNA修复基因（CHK1、RAD51）、削弱DNA损伤修复能力。小鼠Nsun2敲除模型中，造血干细胞祖细胞（HSPC）维护受损，GMP减少而CMP增加，脾脏Ter119+红系细胞增多。体外集落实验证实向红系定向增强而髓系生成受阻。竞争性移植实验表明Nsun2敲除供体细胞长期重建能力严重受损。上述结果表明，NSUN2在造血维持和髓系/红系谱系定向中发挥关键作用。

图5：NSUN2调控白血病细胞增殖和造血谱系定向

（7）白血病细胞系突变与5-azaC敏感性的相关性
最后，研究人员对26个白血病细胞系进行24小时5-azaC敏感性筛选。发现TET2（催化RNA m5C氧化）和ASXL1（PR-DUB复合体组分）突变富集于5-azaC敏感细胞。TET2敲除THP1细胞对5-azaC敏感性增加。此外，IKZF1缺失可增敏K562和NB4细胞，RNA-seq显示IKZF1缺失显著放大转录响应。通过网络推断算法分析鉴定出SRSF2、NPM1和EZH2三个与5-azaC敏感性相关的候选驱动基因，支持了本研究的m5C相关调控轴，为疗效预测和联合治疗提供了新靶点。

图6：白血病细胞系筛选预测与5-azaC敏感性相关突变

结论和启示
本研究通过m5C甲基化测序+CUT&Tag+RNA-seq多组学整合策略，颠覆了5-azaC仅作为DNA去甲基化药物的传统认知，揭示了其更重要的RNA依赖性作用机制。5-azaC通过沉默caRNA m5C，不依赖于DNA去甲基化在早期时间点诱导白血病细胞凋亡；m5C沉默通过MBD6介导的H2AK119ub调控通路和SRSF2/p300/H3K27ac通路导致转录抑制；NSUN2是5-azaC诱导基因抑制的主要m5C甲基转移酶靶点；RNA依赖性效应可能是5-azaC持续给药必要性、与venetoclax联合增效等临床现象的基础。

参考文献：
Gao B, Li Y, Ma X, Zhao L, Zou Z, Hong J, Xiang J, Dou X, Yang FC, Xu M, He C. 5-Azacytosine induces cytotoxicity via 5-methylcytosine depletion on chromatin-associated RNA in leukemia. Mol Cell. 2026 Sep 15. doi: 10.1016/j.molcel.2026.08.018.