【Cell Metabolism】Selective Persulfide Detection Reveals Evolutionarily Conserved Antiaging Effects of S-Sulfhydration
过硫化物选择性检测，揭示 S-巯基化修饰具有进化保守的抗衰老作用

蛋白过硫化修饰（persulfidation，PSSH），是硫化氢（H₂S）信号通路相关的半胱氨酸翻译后修饰，可增强细胞抗氧化能力，调控酶与转录因子活性，维持细胞氧化还原稳态。PSSH 反应活性较高，理化性质又与普通巯基相近，因此在复杂生物样品中难以实现选择性检测。已有 Dimedone Switch 方法可对蛋白 PSSH 进行选择性荧光标记，能反映细胞样品中 PSSH 的整体变化，但无法定位到具体发生修饰的蛋白。

为此，研究者以抗体微阵列方式，将不同靶蛋白的抗体固定在 PolyAn 3D-NHS 96 微孔板中，再加入细胞裂解液，实现实验样本的 PSSH 检测。

作者单位：法国波尔多大学、法国国家科学研究中心（CNRS）等

期刊：Cell Metabolism

发表年份：2019 年

研究对象：野生型、胱硫醚γ裂解酶（cystathionine γ-lyase，CSE）缺失及 D-半胱氨酸处理的小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast，MEF）；10种候选蛋白

基材：PolyAn 3D-NHS 96 孔板（N-羟基琥珀酰亚胺活性酯修饰）

选取 10 种靶蛋白捕获抗体，各 50 μL加入 PolyAn 3D-NHS 96 孔板中，4 ℃孵育过夜。孔板表面的 NHS 活性基团与抗体伯胺发生共价反应，实现抗体固定。经封闭和洗涤后，加入 100 μL 经 Dimedone Switch 处理的细胞裂解液进行杂交。随后，荧光检测仪扫描获取 488 nm（总蛋白）和 Cy5（蛋白过硫化水平）双通道的荧光信号。

结果如图1 所示，胱硫醚γ裂解酶（CSE）缺失处理后，多数靶蛋白的 PSSH 修饰水平降低；D-半胱氨酸处理后，修饰水平则出现不同程度上调，说明不同蛋白的响应存在差异。其中，硫代硫酸硫转移酶（thiosulfate sulfurtransferase，TST）、硫化物：醌氧化还原酶（sulfide:quinone oxidoreductase，SQR）本身 PSSH 水平较高；D-半胱氨酸处理后 PSSH 水平增幅有限，但在 CSE 缺失细胞中修饰水平仍明显下降。此外，检测到超氧化物歧化酶2（superoxide dismutase 2，SOD2）也存在 PSSH 修饰。

图1：PolyAn 3D-NHS 96 孔板用于多靶点蛋白 PSSH 修饰检测。上方为 10 种靶蛋白在野生型、CSE 缺失和 D-半胱氨酸处理条件下的相对荧光信号；下方为 3D-NHS 表面固定抗体并捕获靶蛋白的检测示意图。

利用 PolyAn 3D-NHS功能化 96 孔板以共价方式固定多种抗体，结合 Dimedone Switch 荧光标记，实现多个靶蛋白 PSSH 修饰水平的平行比较。同时，进一步解析了不同处理条件下各蛋白的修饰水平的变化，证实 SOD2 等蛋白存在过硫化修饰，为后续蛋白修饰验证提供了理论依据。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.cmet.2019.10.007

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