Aβ 打进侧脑室，小鼠就“阿尔茨海默”了？并非如此简单！本期，从寡聚体制备到行为学验证，全流程拆解，外加一份避坑清单，一次讲透！

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为什么选 Aβ 侧脑室注射模型？

做 AD 相关的药效筛选或机制研究，第一道坎就是造模。

目前主流选择有两个：转基因模型 (APP/PS1、5×FAD、Tg2576 等) 和 Aβ 脑室注射 (ICV) 模型——用外源 Aβ1-42 肽直接注入侧脑室。

ICV 模型最大的优势是：2 周内即可获得稳定的学习记忆损伤，C57BL/6 等常规小鼠就能做，成本低、周期短，特别适合药物干预、运动干预等需要在"成年动物 + 明确造模时点"上做文章的研究。

▲ 需要特别强调：AD 是一个复杂的“多因一果”疾病，至今病因不明。因此，人类无法制造出 100% 完美的 AD 动物——任何动物模型都只能模拟其部分特征。

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最先要搞懂的事:
你注射的必须是"寡聚体"

这是该模型成功率的第一道分水岭，也是最容易被忽略的一点。

Balducci 等发表在 PNAS 上的经典对照实验给出了明确答案：研究人员精确制备并对比 Aβ1-42 的三种理化状态：新鲜溶解的单体 (initial state)、4°C pH 7.4 孵育 24 h 得到的寡聚体 (oligomer)、37°C pH 2 孵育 24 h 得到的纤维 (fibril)——分别 ICV 注射后做新物体识别测试^[1]。

图 1. 三种制剂的表征^[1]。

结果发现：只有寡聚体组小鼠无法分辨新旧物体 (辨别指数显著下降)；单体组和纤维组与对照组无差异；且这种记忆损伤在 10 天后可自行恢复，说明是寡聚体的急性神经毒性，而非永久性神经元丢失。

 图 2. 注射Aβ 寡聚体的小鼠无法区分新物体，其探索两个物体的时间百分比无显著差异；10天后，在未再次注射 Aβ 的情况下，记忆缺陷完全恢复^[1]。

注射"什么样的 Aβ"比"注射多少"更重要！

⚠ 你的肽溶解之后放着不管，它自己就会慢慢聚集——所以从复溶到注射的时间窗口、孵育条件，都要当成关键参数来管理。

Section.03
Aβ 脑室注射 (ICV)：实验操作

图 3.  Aβ 侧脑室注射 (ICV) 造模全流程示意图。

(一) 人源 Aβ1-42 合成肽

人源 Aβ1-42 合成肽：为 AD 研究中常用的 Aβ1-42 研究级多肽，MCE 可提供HPLC 纯度 ≥95% 的商品化产品 (HY-P1363A)。

图 4. MCE 人源 Aβ1-42 合成肽 (HY-P1363A) HPLC 结图。

(二) 寡聚体制备

β-淀粉样蛋白聚集指南

以 Aβ1-42 (HY-P1363A) 为例

1. 单体化 (HFIP 处理)：

① 将固体 Aβ 肽溶解在冷六氟-2-丙醇 (HFIP) 中。将肽在室温下孵育至少 1 小时以建立单体化和结构随机化。

② 真空干燥以去除所有 HFIP，并将所得肽以薄膜形式储存在 -20°C 或 -80°C 下。

2. 寡聚体制备：

③ 将所得膜溶解于无水 DMSO/0.1M NaOH/1% 氨水中，浓度为 5 mM，然后用无菌双蒸水稀释至一定浓度 (eg: 200 μM)，确保溶清。

④ 接下来，将溶液在 4-8°C 下陈化 24-48 小时。然后将样品在 4-8°C 下以 14000 g 离心 10 分钟；可溶性低聚物在上清液中。将上清液稀释 10-200 倍用于实验。

小建议：

留少量同批样品，用 SDS-PAGE、SEC、TEM 等表征 Aβ 聚集状态^[2]；或先用小批量动物试造模，确认批间有效再正式分组。 

(三) 立体定位注射

——以12周龄 C57BL/6 小鼠为例

1. 麻醉：在准备手术前，用异氟醚麻醉小鼠或腹腔注射水合氯醛。

2. 固定小鼠：将小鼠头部固定在大脑立体定位器上，俯卧位。用剪刀剪掉小鼠头顶毛发，碘伏消毒后用手术刀切开皮肤。

3. 定位：参照小鼠脑立体定位图谱，以前囟 (bregma) 为原点定位侧脑室： 

• 前后方向 (AP)：−0.5 mm
• 旁开 (ML)：±1.0 mm
• 进针深度 (DV)：−2.3~3 mm

4. 注射：将制备好的 Aβ 溶液或等体积溶剂缓慢匀速注射，注射结束后静置针 2~5 min，再缓慢退针——防止液体沿针道反流，这是新手最常见的失败原因。

5. 缝合: 缝合头皮，碘伏消毒，保温至苏醒，单笼饲养至完全清醒。

小白加油站

小鼠脑立体定位手术主要依据三维空间坐标。

它相当于一份“脑部 GPS 导航指南”。因为小鼠的脑袋很小，要想把 Aβ 溶液精准地注入到脑子里那个只有毫米级别的区域如侧脑室或海马区中，需要依靠三个轴的坐标来精确定位。

1. 核心原点：前囟 (Bregma) 

(1) 是什么： 小鼠头骨顶部有几条骨缝 (颅缝)。骨缝交汇的地方有两个标志点，最前面那个呈“十”字交汇的十字路口，就叫做前囟 (Bregma)。

(2) 它的作用： 它是整个手术的绝对零点 (0, 0, 0)。做手术时，实验人员会先用定位仪的注射针头轻轻碰一下这个“十字路口”，然后将仪器的读数全部清零。

2. 三维坐标深度拆解

确定了原点后，接下来就要根据脑图谱查到的参数，假设：AP −0.2 mm，ML ±1.0 mm，DV −2.4 mm (自颅骨表面起算)。在“前后、左右、上下”三个维度移动针头：

• AP −0.2 mm (前后轴，Anteroposterior)

—— 从原点 (Bregma) 往后面 (屁股方向) 移动 0.2 毫米。

注：正数 (+) 代表向前 (鼻子方向)，负数 (−) 代表向后。

• ML ±1.0 mm (左右轴，Mediolateral)

—— 从中线往左侧 (−) 或者右侧 (+) 移动 1.0 毫米。

注：因为小鼠的侧脑室是左右对称的对称轴 (两个房间)，写 ±1.0 意味着你挑一侧注射即可，或者两侧都注。通常习惯注左侧或右侧单侧。

• DV −2.3 mm (垂直深度轴，Dorsovandral) 

—— 针头刺破颅骨后，从颅骨表面 (Dura/Skull surface) 算起，垂直向下扎入 2.3 毫米。

注：这个深度刚好能让针尖穿透大脑皮层，准确悬停在充满脑脊液的侧脑室空腔里。

(四) 术后恢复与测试

• 术后观察 3–5 天，剔除体重持续下降或运动异常的个体；

• 注射后 5–7 天：可开始恢复期行为观察；注射后 1–2 周：正式行为学测试 (多数文献在 1 周后开始水迷宫)；行为学结束后取材做分子/病理验证。

PS：点击查看更多阿尔兹海默症造模方案。

针是否真的扎进了脑室？

最容易出问题的不是“针有没有进去”，而是“进去的是不是侧脑室”。

1. 完美的“落空感”验证——阻力变化：经验丰富的实验员在进针到 −2.2 mm 之后，继续往下推时会感觉到阻力突然微微一轻。这是因为针尖从实体的脑组织 (胼胝体) 扎进了充满脑脊液的空腔 (侧脑室)。

2. 预实验墨水法：新手在正式打 Aβ 之前，通常会用这组坐标打 1–2 μL 的台盼蓝墨水，随后立即断头取脑，横切观察墨水有没有把侧脑室染蓝。如果墨水留在了皮层，说明针浅了，需要把 DV 轴微调加深到 −2.5 或 −2.6 mm。如果看到脑室系统 (甚至顺着循环把第三、第四脑室) 染成蓝色，说明这个坐标在你自己的定位仪上是精准的。

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造模成功的"三层次验证"

不要只测一个行为学就下结论。建议按三个层次验证，证据链才完整：

一、行为学 (必做) 

图 6. Y 迷宫、Morris 水迷宫、新物体识别示意图^[4]。

『Morris 水迷宫』

(1) 训练期：每天 4 次 × 5 天，记录逃避潜伏期——模型组应持续高于对照组且差距逐日拉开；
(2) 探测试验 (第 6 天撤平台)：记录平台穿越次数、目标象限停留时间占比——模型组应显著下降；

注意：记录游泳总距离/游泳速度，排除运动能力差异的混杂。

『Y 迷宫自发交替实验』

(1) 5 min 自由探索，计算自发交替率 (连续进入三个不同臂的次数/总进入次数−2)；
(2) 模型组交替率显著下降，总进臂次数应无组间差异 (排除运动/探索能力差异)。

『新物体识别』

(1) 熟悉期接触两个相同物体，24 h 后以一个新物体替换其一；
(2) 用辨别指数 (DI) 比较——Balducci 实验正是用这个范式证明了寡聚体特异性损伤。

实操建议：至少组合两个行为学范式 (如水迷宫 + Y 迷宫)，单一指标的说服力和审稿通过率都偏低。

二、分子病理 (强烈建议) 

如果行为学告诉我们：“小鼠记忆可能下降了。”那么组织学和分子生物学要进一步回答：“脑里发生了什么？”

① Aβ 相关检测：可采用 IHC、IF、WB 等方法检测 Aβ 相关信号。
② 神经元状态：可结合 NeuN/Nissl/H&E 评价神经元及组织形态变化。
③ 神经炎症：重点关注 Iba1→小胶质细胞；GFAP→星形胶质细胞

三、模型定位质控 (预实验阶段) 

• 注射染料/切片确认针道位于侧脑室；
• 记录围术期死亡率，一般应在 10% 以内。

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结果图怎么看:
预期趋势 + 异常判读

一、水迷宫：训练期潜伏期柱状图

图 7. 侧脑室注射 Aβ25-35 对小鼠空间记忆障碍的影响^[5]。

(A) 实验流程图 (B)逃避潜伏期。

【预期】：对照组潜伏期逐日下降 (Day5 应明显低于 Day1)；模型组下降缓慢、终末仍显著偏高；两组做重复测量方差分析 (组别 × 时间交互应显著)。

【异常信号】：两组曲线平行不下→ 可能寡聚体批间失效，先排查肽制备；模型组忽高忽低 → 检查单次训练间环境和操作者是否一致。

二、水迷宫：探测试验柱状图

【预期】：对照组平台穿越次数、目标象限时间占比显著高于模型组；游泳总速度无差异。

【异常信号】：若模型组游泳速度也明显下降，说明可能有运动/体能混杂 (注射手术应激、体重过轻)。

图 8. 侧脑室注射 Aβ25-35 对小鼠空间记忆障碍的影响^[5]。

(A) 平台穿越次数测试中的典型运动轨迹图 (B) 平台穿越次数。

三、Y 迷宫：交替率柱状图

【预期】：对照组 60–70% 左右，模型组降至 50% 附近或以下；总进臂数无组间差异。

【异常信号】：两组交替率都接近 50% (随机水平) → 可能测试环境应激过大 (噪音、强光)，而非模型失败。

四、WB/免疫荧光图

【预期】：突触蛋白条带变浅、炎症指标条带变深；荧光图上 GFAP/Iba1 表达明显增强、细胞形态肥大。

【异常信号】：加样量不均导致内参参差 → 重新上样；荧光背景过强 → 封闭与非特异结合问题，与模型无关，别急着换动物。

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常见翻车原因排查清单

产品推荐：

β-Amyloid (1-42), human TFA(HY-P1363)

造模试剂，侧脑室注射诱导 AD 样认知损伤。

β-Amyloid (1-40) (human) TFA (HY-P0265A)

在脑内积聚并具有神经毒性，从而诱导阿尔兹海默症。

β-Amyloid (25-35) (HY-P0128)

用于动物建模，以创建阿尔茨海默病模型。

参考文献：

[1] Balducci C, et al. Synthetic amyloid-beta oligomers impair long-term memory independently of cellular prion protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 Feb 2;107(5):2295-300. 
[2] Vandendriessche C, et al. Importance of extracellular vesicle secretion at the blood-cerebrospinal fluid interface in the pathogenesis of Alzheimer's disease. Acta Neuropathol Commun. 2021 Aug 23;9(1):143.
[3] Taylor ZV, et al. An optimized intracerebroventricular injection of CD4+ T cells into mice. STAR Protoc. 2021 Aug 6;2(3):100725. 
[4] Kim DH, et al. Assessment of Cognitive Phenotyping in Inbred, Genetically Modified Mice, and Transgenic Mouse Models of Alzheimer's Disease. Exp Neurobiol. 2019 Apr;28(2):146-157. 
[5] Liu Z, et al. Discovery of oleanolic acid derivatives that inhibit tau protein phosphorylation and neuroinflammation induced by Aβ25-35 in vitro and in vivo. Bioorg Chem. 2025 Sep;164:108866.