高分辨率熔解曲线方法检测不同的DNA杂合体

文章来源：Clinical Chemistry 51, No. 7, 2005

Distinguishing Different DNA Heterozygotes by High-Resolution Melting, Robert Graham,1 Michael Liew,2 Cindy Meadows,2 Elaine Lyon,2 and Carl T. Wittwer1,2* (1 Department of Pathology, University of Utah School of Medicine, Salt Lake City, UT; 2 Institute for Clinical and Experimental Pathology, ARUP, Salt Lake City UT; * address correspondence to this author at: Department of Pathology, University of Utah School of Medicine, Salt Lake City, UT 84132; fax 801-581-4517, e-mail carl.wittwer@ path.utah.edu)

最近，高分辨率熔解曲线法（High-resolution melting）作为一种可以在小的扩增子中来检测单核苷酸多态性基因型的技术被引进。这种基于封闭小管子的方法（包括快循环的PCR）可以在15分钟内完成，并且不需要采用荧光定量PCR仪、等位基因特异性PCR和荧光标记的寡聚核苷酸。该过程通过采用可以检测异源双链DNA的染料得以实现，这种染料在饱和的程度下也不会抑制PCR反应。野生型和纯合子的样品可以通过熔解温度( Tm)的迁移来区别。杂合子样品和纯合子样品可以通过被改变的曲线形状来更好的区分，而不是通过熔解温度。杂合子样品可以产生溶解温度较同源双链更低的异源双链。杂合子产生的被放大的熔解曲线包括2个同源双链和2个异源双链，会产生一个倾斜的复合的熔解曲线。这种熔解曲线在形状上可以很容易与纯合子的曲线加以区别。

然而，在一个扩增子中不同的杂合子是否可以通过不同曲线的形状被区分出来还不太清楚。根据扩增后产生的同源和异源双链的情况，可以将SNPs分为四种类别。不同类别的SNPs异源双链的错配是不同的，因此，如果仪器的分辨率足够有效的话，它们的熔解曲线是可以被区别的。并且，在同种类别中，不同的杂合子也是可以被区别出来。尽管这种错配是相同的，但是最相近的参数稳定性却依赖于相邻碱基的错配，因此，预测出来的稳定性常常是不同的。

我们从ARUP实验室中选取用来做标准临床基因型鉴定的HFE, V Leiden因子和II型多态因子的DNA样品，采用MagNa Pure instrument (Roche)的方法来抽提DNA，采用基于LightCycler的邻近杂交探针[adjacent hybridization probe(HybProbeTM)]的方法来确定基因型。采用探针融合分析基因型的一个优点就是可以用探针鉴定出除了预期改变的序列以为的改变。在ARUP实验室中进行常规的临床分析时，一旦在意外的温度下出现了异常的熔解峰时，样品就会通过进一步的测序来确定序列的改变。在预计的突变附近的一些杂合的序列突变就可以被这样鉴定出来。三个II型杂合子因子（all SNPs），四个V 杂合子 (2 SNPs, 1 个单碱基的缺失和 1 个复合的杂合子)和 6 HFE杂合子 (4 SNPs and 2复合杂合子)可被用来做比较。在选择和完全鉴定样品之后，通过ND-1000 (NanoDrop Technologies, Inc.)来确定DNA的浓度。如果可以的话，每个杂合子基因型的3个样品可以被处理。

除非有必要重新设计引物来检测所有的序列突变，前面描述的引物可以直接去用。SNPWizard 可以(http://DNAWizards.path.utah.edu)被用来设计引物。引物通过Integrated DNA Technologies来合成，并且用的时候不需要进一步的纯化。除了将1X LCGreen ® PLUS (Idaho Technology)换成 LCGreen I外，PCR仍采用以前的程序来扩增。LCGreen PLUS比LCGreen I颜色更加鲜艳，并且可以被用在具有更宽广变化的熔解测定仪上。扩增时的扩增子的序列，引物区域和特定的PCR条件被列在数据附录的表1中。数据附录是和在线版本的技术简要说明（http://www.clinchem.org/content/vol51/issue7/）相匹配的。

PCR结束以后，毛细管在LightCycler中以20 °C/s的速度被加热到90 °C，然后以20 °C/s的速度冷却到40 °C以便更好的形成异源二聚体。将样品从LightCycler中取出，然后在高分辨率的熔解曲线仪(HR-1; Idaho Technology)上进行分析。每个毛细管在59 °C时被插到仪器中，温度以0.3 °C/s的速度上升，从65 到95 °C时encesrozygotese的溶，因此，预测的获取荧光，此过程只需要1至2分钟。通过熔解前的快速降温，熔解过程中的快速加热以及低浓度的Mg离子浓度均有助于检测小的扩增子中异源二聚体。通过普通化的用户软件来分析熔解曲线，不同温度迁移的曲线以不同的图片形式被列出来。不同的图片显示出每个样品和“标准”（通常是多种野生型曲线的一个平均值）样品之间的区别，并且不应该与衍生图 (-dF/dT)相混淆，这种衍生图 (-dF/dT)常常被用来分析低分辨率的熔解数据。因为曲线形状和熔解温度的微小差别就会变得异常明显，因此，作为一种方便的方法，不同的图可从整体上观察高分辨率的熔解数据。

可以通过前面描述过的最近热力学模型（nearest-neighbor thermodynamic models）的计算来预测出的两个Tm值。该模型通过安装Melting Wizard (http://DNAWizards.path.utah.edu)而获得。没有必要去修正因dUTP 代替dTTP的渗入而造成的影响。为了最大程度的增加Tm的区别，扩增子的长度最好比较短，尽管在产物中要想证明SNP的类型常需要超过500 bp的长度。对于不同的SNP( 在线数据附录中的表格2)，计算出的Tm的差异在纯合的野生型和纯合的突 变型的扩增子中变化范围在0.0°C到1.3 °C之间。对于单个的SNP来说，与最稳定的同源双聚体相比，异源双聚体的不稳定性常在1.1°C到3.0 °C之间变化，而与最不稳定的同源双聚体相比，异源双聚体的不稳定性在0.7°C到2.2 °C之间变化。对于复合杂合子来说，各自的不稳定性在2.8–4.0 °C 和2.0–3.5 °C之间。

高分辨熔解技术对于区分相同扩增子内的不同的杂合体是必要的。与高分辨率的HR-1分析方法相比，LightCycler产生的熔解曲线并不能保证分离出杂合子。如图1所示，根据各自的4 对Tm值, 每个杂合子描绘出一条独特的熔解曲线。这些独特的熔解曲线的形状通过标准化的温度移位数据，以不同的图形形式表现出来。在图1A中，II因子和2个稀有杂合子（所有的家族１中的ＳＮＰｓ）可以清晰地从野生型中分离出来，并且也可以将它们彼此分离出来。在图２Ｂ中，Ｖ Leiden因子和3个稀有的杂合子（一个ＳＮＰ，一个１-bp的缺失和一个复合杂合子）同样有独特的曲线。如预期所示，单个的SNPs和１-bp的缺失(单个未配对的基因座位)。在图１Ｃ中，所有被检测的杂合子，包括标记的ＨＦＥ突变，３稀有的ＳＮＰｓ以及２个稀有的复合杂合子都可以被清晰得彼此分离出来，并且也能与野生型分离出来。在所有这些被研究的案例中，不同的杂合子都可以被区别出来，包括那些在同一个ＳＮＰ家族中的杂合子。

在Ｖ因子和HFE的等位基因上，因为２个而不是１个不稳定的位置，因此复合杂合子可以很容易得与“单个”杂合子区别出来。非常有趣的是，纯合的双聚体与杂合的双聚体根据其序列突变的顺式和反式的不同，预测的Tm值也是不同的（在线数据补充中的表２）。这表明，熔解分析方法有可能使单倍体，至少是发生突变的单倍体处于相同的熔解结构域中。

根据其分析方法的不同，目标SNP附近的存在的意外地多态性有可能影响到基因型的鉴定。如果多态性发生在引物下面并且导致不期望的基因座位特异的PCR，所有基于PCR的方法都能进行适当的改变。　同样的问题也适用于被用来测序或者进行延伸反应的内部引物。除此之外，一些基于PCR的方法，包括测序在内，都会识别和区分那些由于限制性片段长度多态性检测方法和基于温探头检测方法未能检测到的多态性。用于用来挑选一系列温度的（熔解检测法）杂交探针方法常常可以发现预料之外的多态性的存在，但是可能需要通过进一步的研究来鉴定它们。在我们的研究中，小扩增子高分辨率的熔解方法可以区别所有被研究的杂合子。这包括２１个配对的比较，表明在小的扩增子中最随机被选取的杂合子都可以被区分出来。

熔解分析法用来区分多序列突变的能力还存在着争议。当野生型的探针被用在标准的低分辨率的系统中时，19%到52%的可能存在SNP的杂合子有可能被与预期的杂合子突变体相混淆。尽管在这些仪器上已经有了关于更好的温度分辨率的报道，但是，很明显，在探针下的稀有序列的突变有可能不能从普通标记的突变中被区分出来。类似的关于扩增子熔化温度确定基因型已经被描述过了，并且着重讲述了Ｔｍ区分变种的限制。　

高分辨率熔解分析方法引入了熔解曲线形状和Ｔｍ来区别不同的突变子。因为复合的杂合子熔解曲线包括2个同源双链和2个异源双链，Tm的含义并不明确，并且作为一种指标，没有熔解曲线的形状那么有意义。复合熔解曲线的Tm是一半的双链已经熔化的温度（传统定义）还是衍生图谱的峰值（普通推导）呢？

这两种并不是一致的，因为异源双链的作用，这样的曲线在低温度下是倾斜的。在这两种情况下，Tm只是熔解曲线上的一个点，采用这种完全的熔解曲线，方便的以不同的模块来显示，可以用来区分绝大多数的杂合子（在本研究中的21中的21对随机的配对比较）。

高分辨率的熔解分析方法分析方便，因为不需要处理步骤和分离步骤。在这种情况下，当目标片段的复杂性超过了扩增子基因型的熔解能力时，可以加入未被标记的寡核苷酸探针。除了确定基因型以外，高分辨率的熔解分析方法还可以作为一种精确的扫描突变的工具被用在中链酰基辅酶A脱氢酶，C-kit和SLC22A5基因以及HLA的配型上。这种方法的特异性和灵敏性比变性的HPLC更强。并且不需要在比如温度梯度，变性梯度或者是构想灵敏胶中进行电泳分析。