许　川1/舒为群1,/张　亮1/曹　佳2/周　新3

(1.第三军医大学军事预防医学院环境卫生学教研室, 重庆　400038； 2. 第三军医大学军事预防医学院军事毒理学教研室，重庆　400038；3. 第三军医大学西南医院烧伤科， 重庆　400038)

 

 

XU Chuan1, SHU Wei-qun1,, ZHANG Liang1, CAO Jia2, ZHOU Xin3

(1. Department of Environmental Hygiene, School of Military Preventive Medicine, Third Military Medical University, Chongqing 400038; 2. Department of Toxicology, School of Military Preventive Medicine, Third Military Medical University, Chongqing 400038; 3.Institute of Burn Research， Southwestern Hospital，Third Military Medical University, Chongqing 400038,China)

 

　　【摘要】 背景与目的： 探讨大鼠卵巢高纯度颗粒细胞培养及鉴定的方法，建立一种简便、稳定的细胞模型。材料与方法： 选用SD雌性大鼠(21～25 d)，皮下注射孕马血清促性腺激素(PMSG)，48 h后用颈椎脱臼法处死，剖取双侧卵巢，采用机械分离方法释放卵巢颗粒细胞，0.25％胰蛋白酶消化结合低速离心分离细胞，用含15％胎牛血清的DMEM/F12培养基，置于37 ℃，5％ CO2培养箱培养。以HE染色和卵泡刺激素受体(FSHR)免疫组化染色对所培养的卵巢颗粒细胞进行鉴定，用MTT法绘制细胞生长曲线，并检测细胞培养液雌二醇(E2)和孕酮(P)的分泌量。 结果： 分离培养的卵巢颗粒细胞存活率>90％，细胞纯度达到95％以上；体外培养的颗粒细胞对数生长期为48～96 h；颗粒细胞具有正常的分泌雌激素功能，在培养24 h细胞培养液中E2和P的分泌量分别为(10.36±15.89) pg/ml和(77.91± 17.24) pg/ml。 结论： 采用机械分离法结合胰蛋白酶消化及低速离心法分离培养的卵巢颗粒细胞纯度高、活性好，用FSHR表达染色鉴定颗粒细胞是一种简便快速的方法。

　　【关键词】 大鼠； 卵巢； 颗粒细胞； 培养； 鉴定

　　中图分类号：R730.45文献标识码： A　文章编号：1004－616X(2009)03－0234－04

 

　　【ABSTRACT】 BACKGROUND AND AIM: To obtain and identify cultured granulosa cells from the ovary of rats so as to establish a convenient and stable experimental model. MATERIALS AND METHODS: Female SD rats were subcutaneously treated with pregnant mare serum gonadotropin (PMSG). Forty-eight hours after dosing with PMSG, the animals were decapitated and the ovaries were aseptically removed. Granulosa cells were then released by mechanical method, trypsin digestion and low-speed centrifugation separation were used for granulosa cells isolation. Granulosa cells were diluted and incubated in fresh DMEM-Ham's F-12 medium (1∶1) containing 15％ of fetal bovine serum at 37 ℃ in water-saturated environment of 5％ CO2. Hematoxylin ＆ Eosin (HE) and immunohistochemical staining of FSHR were used for ovarian granulosa cell identification. Additionally, the growth curves of granulosa cells and hormone levels at different incubation times were evaluated as well. RESULTS: Over 95％ of the cultured cells were ovarian granulosa cells．The exponential phase of growth was between 48 and 96 hours of incubation. CONCLUSION: More than 95％ of highly purified granulosa cells could be obtained by mechanical method combined with trypsin digestion and low-speed centrifugation. Moreover, identifications of granulosa cells by HE and FSHR staining were quick and convenient approaches.

　　【KEY WORDS】 rat; ovary; granulosa cell; culture; identification 

　　颗粒细胞是卵巢的主要功能细胞，其增殖与分化直接影响着卵泡的生长启动、发育、排卵、黄体形成以及甾体激素分泌等卵巢功能活动[1－2]。环境中有毒有害物质对人和哺乳动物的生殖毒害和机制至今仍在探索中，进行颗粒细胞体外培养是研究化学毒物生殖毒性的基础，是探索卵巢内分泌功能及调控机制的重要手段，而如何获得高质量的颗粒细胞是生殖毒理学研究深入的关键。

　　尽管国内外有关哺乳动物卵巢颗粒细胞的体外培养已有文献报道[3－5]，但迄今为止，尚无明确标准、高效、稳定的的培养方法，本研究旨在通过改进和完善颗粒细胞的体外培养和鉴定方法，为进一步开展颗粒细胞体外生殖毒理学研究奠定基础。

 

　　1　材料与方法

　　1.1　主要试剂和仪器

　　DMEM/F12培养基购自美国HyClone公司，无支原体胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司, 孕马血清促性腺激素(PMSG)购自杭州动物药品厂，四甲基偶氮唑盐(MTT)、胰蛋白酶、二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司，DAB显色试剂盒、卵泡刺激素受体(FSHR)兔多克隆抗体购自武汉博士德公司，伊红、苏木素购自北京中杉金桥生物工程有限公司。雌二醇(E2)、孕酮(P)放射免疫测定试剂盒购自北京原子高科股份有限公司。

　　主要仪器包括组织培养显微镜，光学显微镜(Olympus)，CO2培养箱(Thermo Forma)，全自动酶标仪(Thermo)，离心机(湖南湘仪)，GC-911 γ放射免疫计数器(中佳光电仪器分公司)等。

　　1.2　实验动物

　　21～25日龄(50～60 g)清洁级健康SD大鼠10只，雌性，由第三军医大学实验动物中心提供。

　　1.3　卵巢颗粒细胞的分离与原代培养

　　参照Lovekamp等[3]介绍的方法加以改进，雌性SD大鼠，每只皮下注射PMSG 40 IU，48 h后颈椎脱臼法处死。碘伏、酒精消毒，在无菌条件下迅速剖取卵巢放入预冷的无菌PBS中，去除卵巢周围组织及表面包膜，PBS清洗后置于预冷的DMEM/F12培养基中。在解剖显微镜下用25号针头刺破卵泡，使颗粒细胞释放入  DMEM/F12培养基，离心管内吹打分散成单个悬浮细胞。加入0.25％胰蛋白酶－0.02％乙二胺四乙酸(EDTA)1 ml，于37 ℃，5％ CO2培养箱中消化60 min，期间从培养箱取出用吸管反复吹打悬液2～3次(以组织消化为黏液状、颗粒细胞团块分离为准)，加入含有胎牛血清的培养液终止消化，200目不锈钢细胞筛过滤。800 r/min离心5 min，洗涤滤液，弃上清收集细胞。向沉积在离心管底的疏松细胞团中加入DMEM/F12培养基(含15％胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素) 制成单细胞悬液。台盼蓝染色，计数。将细胞稀释成浓度为3.0×105/ml的细胞悬液，接种于培养瓶中或培养板中，在37 ℃、5％ CO2培养箱中预培养24 h后换液1次，去除未贴壁细胞；此后隔日换液1次。

　　1.4　颗粒细胞鉴定

　　1.4.1　HE染色　取生长旺盛的第4 d的细胞，用0.25％胰蛋白酶－0.02％EDTA消化后制成1×105/ml的细胞悬液，种植于已预置好小盖玻片的24孔培养板中，放人CO2 培养箱中，在37 ℃、5％ CO2及完全饱和湿度条件下进行培养。当细胞生长至70％融合时取出玻片，用PBS冲洗盖玻片3次，每次5 min。4％多聚甲醛固定20 min。取出细胞爬片，PBS冲洗2次，苏木素染色2 min，流水冲去浮色，入盐酸酒精中分色数秒，流水冲洗3 min，镜下细胞核染色清晰，胞浆不着色。5％伊红染色2～3 min，流水冲去浮色，梯度酒精脱水，二甲苯透明，封片后光镜下观察细胞形态。

　　1.4.2　FSHR表达鉴定颗粒细胞　细胞爬片制作同前，4％多聚甲醛固定。按以下步骤进行细胞免疫化学染色：固定好的细胞爬片，PBS洗涤3 min×3次；3％ H2O2室温孵育5 min，消除内源性过氧化物酶活性，PBS清洗5 min×3次；加正常山羊血清封闭无关抗原，室温下孵化20 min，倾去不洗。滴加一抗FSHR兔多克隆抗体(1∶200), 4 ℃过夜，PBS清洗 5 min×3次。滴加二抗IgG，37 ℃孵育 60 min；PBS清洗5 min×3次。滴加辣根酶标记链霉素工作液50 μl， 37 ℃孵育 30 min；PBS清洗5 min×3次。DAB 显色(显微镜下控制显色时间)；自来水冲洗，苏木素复染10 min；自来水冲洗3次；常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。

　　1.5　细胞生长特性观察

　　将分离得到的细胞按每孔1×104个接种于96孔板，每孔200 μl。在培养过程中每24 h对试验组进行1次检测，每次检测6个孔，直至接种培养后的第9 d，取各时间点平均值。检测时，每孔添加180 μl 不含血清的培养液和20 μl MTT(5 mg/ml)，37 ℃继续孵育4 h，小心吸弃孔内培养液，每孔加入150 μl DMSO，振荡    10 min，自动酶联免疫检测仪上测定490 nm处的吸光度值(A)，以吸光度值为纵坐标，时间为横坐标绘制细胞生长曲线。

　　1.6　雌二醇(E2)和孕酮(P)含量

　　将生长旺盛细胞接种到24孔培养板，用含15％胎牛血清的DMEM/F12培养基培养细胞，细胞密度为1.0×105/ml，每孔l ml，37 ℃、5％ CO2条件下培养   12 h、24 h后分别收集细胞培养液(在终止培养前3 h加入100 ng/ml FSH)，用放射免疫法测定雌二醇(E2)和孕酮(P)的含量，以评价细胞的功能状态。

 

　　2　结　果

　　2.1　卵巢颗粒细胞形态学观察

　　台盼蓝染色表明，实验分离培养细胞的存活率>90％，初始阶段细胞形状呈圆形或椭圆形，其中有部分小而圆的其他细胞(如红细胞)。卵巢颗粒细胞呈单层贴壁性生长，培养24 h后细胞开始贴壁、增殖；培养48 h后细胞明显增殖，贴壁良好，生长旺盛(见图1，2)。经HE染色后，在镜下可见贴壁细胞形态完整，边缘清晰，大小均一，呈多角形或梭形，核染深蓝色呈卵圆形或不规则形，胞浆淡红色(见图3)。卵巢颗粒细胞形态结构与文献报道一致。

 

　　2.2　FSHR表达鉴定颗粒细胞

　　FSHR免疫细胞化学染色是卵巢内颗粒细胞的特异性染色，FSHR阳性染色定位于细胞胞浆，呈棕褐色着染，细胞核呈深蓝色，镜下可见FSHR的阳性率>95％(见图4)，由此表明分离培养的颗粒细胞纯度达到95％以上。

 

　　2.3　细胞生长曲线

　　细胞生长曲线见图5。由图可见，卵巢颗粒细胞培养初期随着培养时间的延长而增殖，培养24 h细胞处于贴壁生长适应期，A值增加不显著，培养48 h后A值开始大幅度的增高，判断细胞迅速进入对数生长期，到72 h细胞生长极度旺盛，A值达到最大值；随后进入平台期，第5 d开始逐渐下降，6 d开始显著下降直至第  9 d结束吸光度测定。

　　2.4　雌二醇(E2)和孕酮(P)的分泌

　　12 h、24 h的卵巢颗粒细胞培养液E2和P的分泌量见表1，培养液中E2和P的分泌量随着培养时间的延长均升高，培养24 h后E2和P水平均值分别达到103.36 pg/ml和77.91 pg/ml。

 

　　3　讨　论

　　随着生殖毒理学研究的深入，环境化学毒物引起的各种女性生殖损害已引起了人们的高度重视，通过有效地研究环境有毒有害因子对卵巢颗粒细胞生长发育的影响及其调控机制，可深入了解毒物对卵巢毒性作用机理。目前，毒理学研究中对卵巢颗粒细胞的应用越来越广。如何简便、快速、稳定的分离和培养卵巢颗粒细胞是研究化学毒物生殖毒性的基础和必要手段。

　　结合已有文献报道，本实验采用21～25 d雌性SD大鼠进行卵巢颗粒细胞体外培养，相比成年大鼠而言，新生大鼠颗粒细胞在离体前未接触过内源性促性腺激素的刺激，采用PMSG刺激雌性SD大鼠使之处于动情前期，获得大量相同发育阶段的颗粒细胞。进而采用机械分离方法使颗粒细胞释放出来，既减少了对细胞的损伤，保持细胞形态完整，又使污染细胞减少。胰蛋白酶消化结合低速离心分离卵巢颗粒细胞可去除其他混入的细胞(如红细胞)及组织碎片，提高颗粒细胞存活率和纯度。体外培养24 h后颗粒细胞开始贴壁生长，48～96 h内细胞大量增殖，生长旺盛，并可获得较高的细胞存活率，实验结果与文献报道一致[3－4]。

　　鉴于颗粒细胞是卵巢内唯一可表达FSHR的细  胞[6－7]，笔者在通过HE染色观察颗粒细胞形态学特点的基础上，特别采用细胞FSHR表达阳性作为鉴定颗粒细胞的标准。结果表明，在培养的颗粒细胞中，FSHR的阳性率可达到95％以上，获得的高纯度颗粒细胞可最大程度保存细胞的特性，将使系列生殖毒理有关实验数据更加可信。卵泡颗粒细胞在维持雌性生殖功能上具有重要作用，颗粒细胞分泌雌激素为卵细胞的生长和发育提供了重要的微环境。实验期间，颗粒细胞培养液中E2和P分泌量随着时间增加而升高，表明培养的细胞具备并可维持正常的生理功能。

　　综上所述，纯度高、活性好的原代培养颗粒细胞可为化学毒物毒性评价提供一个很好的实验基础。本实验所建立的细胞培养体系是可行的、理想的，适合进行相关毒理学实验。

 

　　参考文献：

[1] Havelock JC, Rainey WE, Carr BR. Ovarian granulosa cell lines[J]. Mol Cell Endocrinol，2004,228(1/2):67－78.

[2] 卢翠玲，杨　巍，胡召元,等. 颗粒细胞的增殖分化及其在卵泡发育中的作用[J].科学通报，2005，50(21):2341－2347.

[3] Lovekamp TN,Davis BJ.Mono-(2-ethylhexyl)phthalate suppresses aromatase transcript levels and estradiol production in cultured rat granulosa cells[J]. Toxicol Appl Pharmacol，2001,172(3)： 217－224.

[4] Davis BJ, Maronpot RR, Heindel JJ.Di-(2-ethylhexyl) phthalate suppresses estradiol and ovulation in cycling rats[J]. Toxicol Appl Pharmacol，1994，128(2)：216－223.

[5] 张天宝.大鼠卵巢细胞体外培养及生殖毒理研究中的应用[J]. 卫生毒理学杂志，1997，11(2):128－130.

[6] Simoni M, Gromoll J, Nieschlag E. The follicle-stimulating hormone receptor:biochemistry, molecular biology, physiology, and pathophysiology[J]. Endocr Rev,1997,18(6):739－773.

[7] 白晓红，糜若然，岳天孚，等. 体外培养人卵巢黄素化颗粒细胞的鉴定及其分泌功能变化[J]. 中华妇产科杂志,2005，  40(5):351－352.

收稿日期： 2008－10－27； 修订日期： 2008－12－24

基金项目： 国家自然科学基金重点项目(30630056)；国家自然科学基金青年科学项目(30800900)；重庆市重大科技专项 (CSTC2006AA7003)

作者简介： 许川(1980－　)，男，湖北荆门人，主治医师，博士研究生，研究方向：环境毒理学。E－mail:xuchuan100@163.com.

Correspondence to： SHU Wei-qun, E－mail: wqshu@mail.tmmu.com.cn