Ying Qing Yu 与 Martin Gilar  / 美国马萨诸塞州米尔福德沃特世公司

简介

本应用纪要中，我们介绍了沃特世专利 RapiGest™ SF 试剂的物理化学性质及其应用领域。 2002 年，我们首次推出 RapiGest SF ，这一创新产品是帮助酶消解的有利工具，可促进溶液中蛋白的消解，它能够改善样品制备过程中蛋白的溶解度。

RapiGest SF 提高酶解速率与完全程度的机理详见图 1 。温和的蛋白变性可打开蛋白结构并暴露酶切位点，以供酶切。在 RapiGest SF 溶液中，酶对变性的耐受性优于普通蛋白，并能保持活性。在加入酶之前高温加热 RapiGest SF 溶液可使球蛋白更为完全变性，之后需将酶与样品一起进行 37 °C 的孵育。 1,2

超过 200 多家行业内杂志引用了使用 RapiGest SF 进行样品溶解的案例，大部分为蛋白组学的应用。最近，许多制药实验室使用 RapiGest SF 用于蛋白药物的确证。因为酶消化的速度的提高并在 LC 、 MS 分析前极易清除， RapiGest SF 已被多个应用领域广泛接受，其中包括高级序列研究的 LC/UV/MS 蛋白药物的肽图分析。

讨论

什么是 RapiGest SF?

RapiGest SF 是酸性不稳定表面活性剂，在酸性条件下极易水解。 1 这种独特的性质，在需要的时候，可用于从溶液中清除表面活性剂。 RapiGest SF 的结构及其水解副产物见图 2 。酸性不稳定的性质可在 pH2 条件下， 45 分钟内达到完全降解。 1

该表面活性剂可降解为两个产物： dodeca-2-one 和 3- （ 2,3- 二羟基丙基）丙磺酸钠。前者与水不能互溶，可通过离心清除。后者在水溶液中溶解度很高，而在反相 LC 模式下不保留。酶消解后的水溶液可直接进行 HPLC 、 LC/MS 或 MALDI-TOF MS 进行分析。

消解后的清除

样品分析前无需额外去清除表面活性剂（如透析）。在分析前，酶消解后通常经过酸（如甲酸、三氟乙酸（ TFA ）或盐酸（ HCl ））的酸化，降解 RapiGest SF 。建议降解条件 pH ≤ 2 。

胰蛋白酶消解的兼容性

胰蛋白酶是最常见的蛋白水解酶，可用于肽图分析和蛋白组学的应用。我们研究了在添加 RapiGest SF 的情况下胰蛋白酶的活性作用，并与文献中最常见的变性剂的作用做了对比。本检测基于胰蛋白酶诱导 N-α- 苯甲酰 -L- 精氨酸乙基乙酯（ BAEE ）在 50 mM 重碳酸胺（ pH 7.9 ）中的室温水解。胰蛋白酶活性的变化通过 UV 253 nm 下测量 BAEE 水解率进行计算。在选择的变性溶液中，胰蛋白酶活性与对照样品进行对比（非变性剂）。结果见于表 1 。

表 1 中的数据说明低浓度下（ 0.1% ） RapiGest SF 不抑制胰蛋白酶的活性。这与结构上类似的表面活性剂 SDS 不同， SDS 是很强的变性剂，可会使胰蛋白酶失活。尿素、乙腈或盐酸胍也是胰蛋白酶消化的变性剂。但是乙腈是强洗脱剂会干扰消解样品进行反相 LC 分析。正如我们所知，尿素可使蛋白共价修饰，盐酸胍也和 SDS 一样可以使酶失活。

本实验说明蛋白酶的活性受到蛋白溶液中所用变性剂的影响。 RapiGest SF 在从低到高的浓度下均不改变酶活性，因此，最佳的蛋白消解条件是无需过量酶即可达到酶解的结果。

快速蛋白消解

对蛋白酶解存在抗性的蛋白使用 RapiGest SF 试剂，可在数分钟内消解完全。完全消解球蛋白、马肌红蛋白只需要 5 分钟内即可完成。该试剂辅助的消解结果与对照见图 3 。由于肌红蛋白是 球蛋白 ，众所周知，若没有表面活性剂将难以消解。在对照反应中，与胰蛋白酶孵育 9 小时后只有少量的蛋白可以消化。使用了 RapiGest SF 试剂，总体的消解的效率显著提升。

在蛋白药物肽图中的序列覆盖范围更大

RapiGest SF 在蛋白组学的样品前处理中广泛使用，是有效的蛋白溶解变性剂。最近越来越多的生物制药实验室在肽图分析中采用了 RapiGest SF 。一些发表的论文记录了使用 RapiGest SF 进行蛋白药物消解的优势。 4,5 经报导的 RapiGest SF 浓度范围为 0.05 -1% ，取决于蛋白疏水性与浓度。

我们发现浓度范围为 0.05 -1% 的 RapiGest SF 足以使各种大小的蛋白变性，高浓度 RapiGest SF 适合全细胞蛋白提取的实验。

单抗（ mAbs ）肽图分析一直以来都因为难以消解这些大疏水蛋白而难以实现。肽图分析的目的是确认蛋白序列并发现所有存在后翻译修饰（ PTMs ）的蛋白。图 4 举例说明了 RapiGest SF 辅助的人单抗消解的实例。样品制备与分析的参数以 UPLC ® 和四级杆 Tof 质谱分析的参数已列表作为指导。

人化单抗 IgG 多肽图谱

蛋白序列覆盖率 = 98%

图 4 显示实验中总序列覆盖率为 98% 。数据分析通过 BiopharmaLynx™ v.1.2 软件得到。高序列覆盖率（ 98% ）说明单抗完全消解。 LC/MS 分析中没有发现错误酶切的多肽或完整未被酶切的蛋白。剩下的 2% 未确认的序列为少数二个氨基酸的肽或单个氨基酸（ R 或 K ），而无法在反相柱上保留。

样品制备

人单抗样品（ 10 μL, 21 mg/mL ）在含有 0.1% （ w/v ） RapiGest SF 的 50 μL 50 mM 重碳酸铵中溶解。将 2 μL 0.1 M 的二流苏糖醇（ DTT ）加入样品，样品在 50 °C 加热 30 分钟，加入 4 μL 0.1 M 的碘代乙酰胺，在样品冷却至室温后样品在黑暗中静至 40 分钟。

样品中加入 8 μg 胰蛋白酶（胰蛋白酶浓度 = 1 μg/μL ），样品在 37 °C 孵育过夜。消解样品与 1% 甲酸与 10% 乙腈混合（ 1 ： 1 ， v ： v ）。用 Milli-Q 水（ Millipore ）稀释至 5 pmol/μL 后进行 LC/MS 分析。

LC 条件

LC 系统： 沃特世 ACQUITY UPLC ® 系统
色谱柱： ACQUITY UPLC BEH 300 C 18 肽分离专用柱 , 2.1 x 100mm （ P/N = 186003686 ）
柱温： 40 °C
样品进样： 2 μL （ 10 pmol ）
溶液 A ： 0.1% 甲酸水溶液
溶液 B ： 0.1% 甲酸乙腈溶液
流速： 200 μL/min
梯度： 0-2 分钟 :2%B
2 – 92 分钟： 2 -35% B
92 -102 分钟： 35 - 50% B
102.1 -105 分钟 ： 90% B
105.1-110 分钟： 2% B

MS 条件

MS 系统： 沃特世 SYNAPT™ MS （ V 型）
毛细管电压： 3.2 kV
源温度 . ： 120 °C
去溶剂温度 . ： 350 °C
去溶剂气： 700 L /hr
MS 扫描速率： 1 秒 / 次

锁定质量通道 ： 100 fmol/μL Glu-Fib 多肽（ m/z 785.8426, z = 2 ），流速 20 μL/min

与其他的蛋白酶合用

我们测试了 RapiGest SF 与多种蛋白酶的适配性，如 Asp-N, Lys-C 与 Glu-C 。在酶解前使用 RapiGest SF 变性蛋白获得了有效的消解结果。

蛋白去糖基化的用途

RapiGest SF 也用于测试其它酶，如 PNGase F ，该酶用于酶切糖蛋白 N- 连接的糖基。 2 图 6 说明了去糖基化鸡蛋卵清蛋白。在 RapiGest SF 介质中 PNGase F 消解 2 小时后观察到了完全的去糖基化反应。

结论

•  RapiGest SF 促进了蛋白酶解的速度与完全程度，能够得到蛋白药物序列覆盖率很高的肽图分析。

•  RapiGest SF 是适用于蛋白组学、糖蛋白与生物制药应用的领域

•  几乎无需消解后样品处理，简单样品酸化，足以从溶液中去除 RapiGest SF 。多种情况下 LC/MS 分析前只需简单稀释。

•  RapiGest SF 简化了样品制备方法，可提高分析通量；使用该方法提高实验室工作效率并提高数据质量。

参考文献

1. Yu YQ, Gilar M, Lee PJ, Bouvier ES, Gebler JC. Enzyme-friendly, mass spectrom- etry-compatible surfactant for in-solution enzymatic digestion of proteins. Anal.

Chem. 2003; 75: 6023-6028.

2. Yu YQ, Gilar M, Lee PJ, Bouvier ES, Gebler JC, A complete peptide mapping of membrane proteins: a novel surfactant aiding the enzymatic digestion of bacteriorhodopsin. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2004; 18: 711-715.

3. Yu YQ, Gilar M, Kaska J, Gebler JC. A rapid sample preparation method for mass spectrometry characterization of N-linked glycans. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2005; 19: 2331-2336.

4. Bailey MJ, Hooker AD, Adams CS, Zhang S, James DC. A platform for high- throughtput molecular characterization of recombinant monoclonal antibodies, J. Chrom. B. 2005; 826: 177-187.

5. Huang HZ, Nichols A, Liu DJ. Direct identification and quantification of aspartyl succinimide in an IgG2 mAb by RapiGest SF assisted digestion. Anal. Chem.

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