多个序列突变的筛查-高分辨率熔解曲线分析（HRMA）

摘要：双链DNA分子转化为两个单链分子，DNA分子变性或熔解用于研究DNA结构和组成已经有多年。最近，新技术的进步提高了这种技术的潜力，尤其是用于DNA序列突变的检测。通过饱和DNA染料的发展和设备的改善，熔解的灵敏度和特异性有了很大的提高（改良的温度精确地结合每个时间单位温度的精确测量）。熔解分析已使用这些新设备用于高分辨熔解曲线分析（HRM或HRMA）。基于它的易用性、灵活性、低成本、非破坏性、高灵敏度和特异性的特点，高分辨熔解曲线分析已成为筛选病人致病突变的首选工具。这里我们将简短地讨论高分辨熔解曲线分析目前的发展，特别回顾它在其它方面的应用，包括前序列筛查，单核苷酸多态性分型，甲基化分析，定量（拷贝数变异和镶嵌性），替代凝胶电泳和克隆。总之，这些不同的应用使高分辨率熔解曲线分析成为了一种多用途的技术和标准，可用于任何核酸研究的实验室中

关键词：突变筛查；甲基化；熔解曲线分析；HRM；HRMA

硬件

    有几个供应商生产高分辨熔解曲线分析系统（HRM或HRMA）。整体而言，这些系统能达到预期的结果，但是差异很大[Herrmann et al., 2006, 2007]。目前可用的灵敏度最高的系统是HR-1(盐湖城市，由他大学，爱德华科技有限公司)，荧光信号产生于55—95℃，温度以0.1℃/s升降，200个数据点/℃。一些实验，例如，多个SNP测定[Seipp et al., 2008]，关键取决于这个分辨率。HR-1使用玻璃毛细管每次分析一个样品；其它玻璃毛细管系统可分析32个样品。微孔板系统更受欢迎、使用方便，可同时分析96或384个样品。另一个区别是系统是否仅用于高分辨率熔解曲线分析或是否是PCR结合高分辨溶解曲线分析的设备。Rouleau等很好地证明了定量PCR结合HRMA设备在同一个实验中可以用于定量（缺失/重复）和定性（核苷酸）的改变。
    在大多数系统中小的板孔之间的温度差异影响灵敏度。Seippet al. [2007]通过增加控制温度的低温和高温温度校准探针避免这个问题。分析软件可以利用探针的熔解位置弥补板孔之间的温度差异，减小Tm标准偏差38%，显著地提高了灵敏度。值得注意的是，高分辨熔解曲线分析软件的使用决定最终灵敏度的重要因素[Herrmann et al.,2007]，但并不是所有的软件包有利于温度校准探针的使用。
    LC-Green是第一种可用的饱和染料[Wittwer et al.,2003];目前，已有多种饱含染料。包LCGreens1(IdahoTechnology Inc.), Syto9s (Invitrogen, Carlsbad, CA), EvaGreens (Biotum) 和LightCyclers 480 ResoLight Dye (Roche, Indianapolis,IN)。价格差异很大；所有的饱和染料都有一些差异，它们对PCR缓冲液和反应条件要求略有不同。
高分辨熔解曲线分析的完成非常简单。最简单的设置，不需要对现有条件修改，添加染料后进行PCR熔解。这个简单方法允许我们，例如很快的区分apoE等位基因的所有可能情况（Fig.1A）。ApoE使用其它分型技术存在许多问题，主要是要求每个等位基因区分开。最后，高分辨熔解曲线分析是一个闭管实验，染料在PCR反应前加入更好。如果实验要求改变PCR条件，通常可以增加镁离子浓度2-3 μL，退火温度增加1-5℃。当镁离子浓度升到设备的最大温度以上时，加像二甲基亚砜（10%）或犊牛血清（0.5M）可以降低Tm值。对于复杂的实验，使用梯度PCR仪可以快速的确定最佳的退火温度。
高分辨率熔解曲线分析在不同实验室不要求有大的改变，同时也不要特别的技术；它是在有特殊染料存在的条件下PCR条件过程进行小的修改。最昂贵的是设备的购买。在10,000-50,000欧元之间，根据系统，甚至其它一些技术相比它并不逊色。因为高分辨率熔解曲线分析不像许多其它技术（例如，SSCA，DHPLC，DGGE,或毛细管电泳），不需要PCR后分离，更重要的是节省成本。此外，高分辨熔解曲线分析是一个非破坏性的技术，同时可以进行后续的分析，比如，熔解分析后进行凝胶电泳或测序。

图1.使用高分辨熔解曲线分析检测序列突变。A：检测所有六个可能的ApoE等位基因组合；PCR后高分辨熔解曲线分析前添加LC-Green+染料（PCR包含10%DMSO）。ApoE 3/3等位基因作为标准（水平的灰线）。B-D：使用氨基封闭的非标记探针检测MBL2基因第一个外显子的3个独立突变(Roos et al., in preparation)。B：衍生图全图；C:放大的低熔解探针和D：（PCR片段）Tm峰。使用熔解图10种等位基因可以清楚地区分。

应用

突变检测

    高分辨熔解曲线分析已用于DNA序列突变的检测，是第一个用于基因分型中的技术[Wittwer等,2003]。简便、廉价、容易使用、高灵敏性和高特异性是它的突出特点，使它成为一种用于基因分型和诊断应用实验室中有吸引力的新工具。在萨普，表S1给出了我们所能找到的基于人类基因的实验。高分辨熔解曲线分析系统结合功能强大的软件工具可以便利地自动分析，然而人工检测依然可用。目前，使用高分辨熔解曲线分析检测突变已经通过审查[Erali et al., 2008];因此，我们仅用于一般解释。此外，高分辨熔解曲线分析用于人类突变的检测已经有多篇文章发表。充分说明了其目前的发展水平(see also Supp. Table S1)。
    Tindall等[2009]对比了两种设备和荧光染料，特别是高GC含量片段DNA突变的检测。 他们说明了高分辨熔解曲线分析的限制，谨慎使用它作为临床诊断的唯一方法。Nguyen-Dumon等[2009]表明包含使用已知SNP结合稀有突变熔解探针显著减少测序的能力。Van Der Stoep等[2009]类似的方法设计了覆盖BRCA1基因的序列突变扫描，包括已知频率SNP的熔解探针。EuroGenTest通过多个实验室进行评估和验证HRMA作为新基因筛查的准则。在对28个失明患者的研究结果为100%的灵敏度、98%的特异性，假阳性率低。Rouleau等[2009]在同一个实验中使用一些设备完成定量PCR和HRMA去筛查核苷酸数量（缺失/重复）和质量的改变。最后，Dobrowolski 等[2009]描述了在两小时之内使用HRMA扫描16.6kb人类线粒体基因组（mtDNA）序列突变。线粒体DNA突变的识别比较复杂，因为许多是异质的，同时突变等位基因以高变化率存在。事实上，作者成功地确认在1-100%的突变存在，很好地显示了HRMA检测定量变化的灵敏度（见量化）
    尽管已有报道HRMA片段达600bp或更高，但我们的实验显示该技术对小片段更灵敏。对于片段筛查，使用150-250bp片段，通常每个外显子一个片段。当实验进行的是特异突变，我们的目标片段大小是80-100bp。我们发现高灵敏度的关键是熔解图不会超过一到两个熔解区域。当片段包含了多个熔解区域，并不是所有的突变能检测出来。目前新的实验设计简化了强大的可用性设计项目，大多数情况下是和仪器一起交付。
    在早期HRMA实验中可以看到两个有时甚至三个PCR产物熔解，可以提高结果。同样，特别是当DNA片段分浓度差异较大时，添加1 μL高盐缓冲液（1.0M KCL,0.5M Tris-HCL [PH=8.0]）可以改善实验结果（图 2）。添加盐可以提高分辨率同时促进集群，但这种方法的成功率是不可预测的，它取决于样品、片段和突变分析。

图2.高盐的影响.A:HRMA一系列样品的分析。B：同样的样品在A分析后添加1 μL 1.0M kcl/0.5M Tris-HCl(PH=8.0)再熔解。留意分离的改善和三组图像变尖。

    当一些简单的原则都考虑到时（比如，避免长片段和多重熔解域），设计一个基因的HRMA筛查非常简单。我们曾成功地设计实验筛查MDM基因第79个外显子90个片段(Al-Momani et al)。Nguyen-Dumont 等 [2009] 和Van Der Stoep 等[2009]表明，非标记探针识别已知非致病突变时，不仅省时而且能够节约成本。防止这些片段不必要的测序，同一个片段避免忽略其它突变。
    应该指出HRMA曲线的形状通常不足以区分一个特异突变[Tindall 等, 2009];完成这个实验必须添加探针或片段测序。非标记探针区分特异探针或复等位基因的能力式惊人的。图1B-D为例子(Roos 等，准备)。使用包含野生型序列的熔解探针可以区分MBL2基因中三种相近空间突变的10种可能等位基因。
    最便宜的熔解探针3ˊ磷酸盐封闭可以防止PCR过程中的延伸。遗憾的是，这种探针不稳定，同时会出现不理想的额外熔解峰。其它探针较稳定但价格昂贵。Zhou等[2008] 使用snapback 引物完美的解决了这个问题，它是5ˊ端引物包含了循环区域和序列互补其延伸产物，覆盖突变筛查。 HRMA的一个缺点是对纯合子突变的检测。尽管随着目前的发展分辨率已得到很大提高 [Gundry 等.,2008],  对一些突变的差异（如A-T到T-A改变）由于变化非常小所以很容易错过。尤其是分析不同来源的样品，样品到样品的变化、实验噪音增加和微小的变化可能不能被检测到。因此，序列突变筛查应用时（临床诊断），我们坚持使用样品混合产生异源双链。首先，样品熔解得到一个标准的熔解曲线。下一步，使用图表显示（图3为DMD设计，X轴与疾病相关），混合样品同时产生第二个熔解曲线。样品混合图每个样品产生了两个杂交双链（样品很容易地自动混合）。纯合子将产生两个杂交双链，极大地提高了纯合子的检测。杂交双链将通过预混的熔解曲线检测到，尽管它们通常通过混合样品显而易见。（混合比例为1︰3）。当混合相同突变样品时，仅显示失败的样品，可以通过增加更多的控制或仅混合不相关的样品可以简单地预防 。必须指出 体系的存在可以从真正的纯合子等位基因区分半合子。

图3.生成异源双链。为了确保纯合子突变的检测，可以使用显示的方案。板孔1-12包含每个样品（患者A-F和wt=wild-type控制）不同片段（外显子）的PCR产物。第八排为空。从第一个从第七排（wt，5-10 μL PCR产物）样品的一半HRMA混合开始，然后转向第八排。随后，第六排一半量转向第七排，第五排一半转向第六排等等等。最后，第八排转向第一排，然后片段再次熔解。

    应当指出，HRMA检测杂合子的灵敏度高于DNA测序。因此，当HRMA显示突变存在，而测序不能确认时。可能是这个突变存在也样品相对小的片段（体细胞嵌合体）。其它技术：如，克隆+测序或单分子稀释+PCR和HRMA，可以确认这些突变。

前序列筛查

    使用HRMA进行前序列筛查，特别是对于大基因可以节省很大的成本；Provaznikova 等[2008]报道对于MYH9基因可以避免85%的测序。在例中的DMD基因，第79个外显子需要分析(Al-Momani 等)，假定每个外显子测序需要10欧元，筛查一个患者总共需要800欧元。每个外显子PCR花费1欧元，HRMA染料花费0.1欧元，每个患者估计花费90欧元。假定序列分析需要5个外显子熔解需要分析（包括一个致病突变，三个非致病突变和一个假阳性）需要增加50欧元，总花费为140欧元。每名患者将节省650欧元，当使用熔解探针去确定常见非致病突变存在时，将会减少更多的花费。事实上，基于这些图，五个外显子基因的HRMA预筛查已经很划算。此外，检测体细胞的变化或异质性[Dobrowolski 等.2009],HRMA比测序似乎更灵敏。
 
SNP分型

    HRMA用于SNP分型有很大的吸引力。实验设计廉价、简单、速度快。当在一个特定区域设计一到两个PCR覆盖一个SNP，至少一个通常两个将得到很好的结果。提高灵敏度，片段必须够小（80-100bp），当可以选择时（比如：在单倍体中）应选择G-A突变（预计得到最大的熔解变化）[Reed 和Wittwer, 2004]。推荐添加非标记探针[Nguyen-Dumont 等, 2009; Zhou 等,2008]，得到了双重检测同时提高了纯合子突变检测率。当设定的引物到达时，不用做一到两次的 PCR去摸索扩增条件。检测成本仅仅PCR费用，实验设计花费可以忽略。除非有大量的样品需要分型，染料成本相对于实验成本包括具体的标记探针（例如，TaqMan）而言比较低。HRMA样品吞吐量可以通过使用自动进样板增加，在一些系统中可用一些延伸或安装一个附加的进样器。
    根据上面描述的阳性结果是否重复可变数目，特别是CA重复，可以被HRMA分型（图4）。虽然样品所有的熔解曲线可以清楚地被区分，我们发现所有可能结合的等位基因很多，所以杂合子CA重复分型不能准确确定。可以通过小的家族去检测家族成员间的差异同时研究杂合子样品的杂合性（LOH）缺失。正如Intemann等[2009]的实验结果，可以推测熔解探针的添加跨越最小的或最大的等位基因可以更大的增加分辨率。
HRMA的一个缺点是不能轻易应用使用多重模式，同时进行几个不同片段同时分型突变。按理来说，可以利用颜色差异，温度差异完成多重模式。Seipp等[2008]利用最简单的方法，Tm差异成功地设计了一个四倍体基因分型实验。然而，这些设计时间多少和成功决定于高质量的DNA样品和HRMA系统的灵敏度使用。

图4.  使用HRMA分析CA重复。 六个不同DNA样品重复分析，所有的都是杂合子。上图：归一化温度变化熔解3=14/17,4=14/18,5=15/21,6=14/21。

甲基化

    目前，基因组研究经常涉及表观遗传学标记，尤其是CPG二核苷酸在基因表达、印记和肿瘤的甲基化(Ehrich等2006)。这些程序关键的步骤是基因组DNA的处理，不断改变的非甲基化C核苷酸（不是甲基化Cs）到我们。HRMA可以应用在这些研究中的两个阶段。首先，成功治疗的前后可以通过控制的基因组片段的PCR检测，没有甲基化的CPGs和100%甲基化样品样品的熔解曲线。越接熔解图近类似于片段100%的转变，治疗后越好[Worm等.2001]。其次，HRMA可以用于确定C-U转变的百分率，直接用于熔解探针的结合[Maat等.2007]或克隆后。

量化— 确定镶嵌性和拷贝变异数量
                                                                 
    根据熔解曲线变化,HRMA可以用于量化分析；较大的变化、较小的差异可以被检测到。确定突变分子数量常用的技术为双氧法测序（分辨率下限为20-30%）和焦磷酸化测序法（下限为1-10%）。虽然功能强大，焦磷酸测序法是一种劳动密集、昂贵同时需要专门设备的方法。我们成功的应用HRMA确定不同等位基因的数量[Aten等, 2009; Bruder等, 2008]，同时显示检测12.5%的步骤（1/8）通常是可以的[Aten等2009]。结肠癌中体细胞检测的应用见图5。使用稀释系列作为一个标准，可以快速确定三个疑似携带致病突变患者的体细胞嵌合体水平达5-10%。这些数据和通过焦磷酸测序获得的结果完全吻合[Hes等,2008]。然而检测费用低廉同时易于操作。应当指出当使用熔解探针时分辨率会提高到5%以下。等位基因表达差异确定的其它应用，基于突变在mRNA中的存在和mtDNA杂合子的检测[Dobrowolski等, 2009]。

    目前，我们使用相同的方法研究一对双胞胎细胞携带体细胞缺失的片段。[Bruder等, 2008]。当筛查患者基因组改变相关疾病时，采用该方法也可以用于确认CNVs（缺失和重复）。根据不同的设置，像FISH、MAPH   [Armour等, 2000],  MLPA [Schouten等, 2002], MAQ [Suls等, 2006], 和 qPCR 技术可以用于确认阵列结果。然而这几项技术要么成本昂贵要么需要进一步的发展。任何可疑区域的SNP都可以使用HRMA确认。这些纯合子样品对于的等位基因（AA和BB）和潜在的携带变化的样品1﹕1混合。假定检测样品携带了A等位基因，要么是AO,要么是AA。当与纯合子BB样品1:1混合，缺失确定时，熔解图样品AA:BB以1：2的比例混合（AOBB）。当样品AA:BB以1：1比例混合时，缺失不存在  （AABB）。当1：1纯合子样品BB样品 与3：2 AA: BB样品混合（AABB）。                                                                   

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