DAP-seq助力揭示多年生黑麦草转录因子LpNAC22增强耐旱性的分子机制
2025-07-08 来源:本站 点击次数:442025年6月10日，西北农林科技大学秦涛教授团队在Plant, Cell & Environment发表了题为“NAC Transcription Factor LpNAC22 Positively Regulates Drought Tolerance in Perennial Ryegrass”的研究论文。该研究从多年生黑麦草中分离出干旱诱导的NAC转录因子LpNAC22，借助DAP-seq系统解析了LpNAC22通过调控LEA家族基因增强耐旱性的分子机制，为牧草抗旱分子育种提供了关键理论依据与基因靶点。
研究背景
多年生黑麦草是全球温带地区广泛使用的牧草和草坪草，但对干旱敏感，缺水会导致生长、turf质量和生产力下降。植物通过分子和生理机制抵抗干旱，其中转录因子（如NAC）起重要调控作用。尽管NAC在多种植物中被证明与耐旱相关，但多年生黑麦草中NAC的耐旱调控机制尚不明确。
技术路线
研究结果
作者从多年生黑麦草中分离出13个与NAC转录因子高度同源的编码序列，其中LpNAC22在干旱胁迫后转录水平更高，且在高抗旱性品种中表达量显著高于低抗旱性品种。系统发育分析显示其与多个干旱响应型NAC蛋白属于同一亚组。亚细胞定位表明LpNAC22定位于细胞核，转录活性分析显示其具有转录激活功能，且转录激活区域位于C端（138-331氨基酸）。
图1. LpNAC22转录因子的基因表达分析与系统发育关系。
图2. LpNAC22的亚细胞定位与转录活性分析。
图2. LpNAC22的亚细胞定位与转录活性分析。
作者接着研究了LpNAC22在调控多年生黑麦草耐旱性中的功能。干旱处理诱导LpNAC22表达后，其在拟南芥和多年生黑麦草中过表达均能提高植株存活率、相对含水量和叶绿素含量，降低丙二醛含量、离子渗漏和活性氧积累，减轻细胞损伤，增强耐旱性。进一步构建了两个突变株系（Ri2和Ri3），干旱处理前突变株系与野生型植株表型和生理指标无差异；但干旱处理后，突变株系存活分蘖率、株高、干重、相对含水量和叶绿素含量均低于野生型，离子渗漏率、丙二醛含量及活性氧积累则高于野生型，表明LpNAC22突变会导致细胞膜损伤加剧。以上结果表明，LpNAC22在多年生黑麦草抗旱性调控中起正向作用。
图3. LpNAC22过表达增强了转基因多年生黑麦草的耐旱性。
图4. LpNAC22基因突变削弱多年生黑麦草的干旱处理耐受性。
图4. LpNAC22基因突变削弱多年生黑麦草的干旱处理耐受性。
为探究LpNAC22调控抗旱性的机制，作者通过DAP-seq分析，发现9165个启动子片段被富集，覆盖5195个基因。GO富集分析表明其中富集多种胁迫响应基因，包括水分剥夺相关基因。值得注意的是，8个LEA家族基因的启动子区域在DAP-seq结果中呈现显著富集，结合生理实验中LpNAC22过表达植株细胞膜损伤减轻的表型（MDA含量降低、离子渗漏减少），推测LpNAC22可能通过调控LEA基因表达保护细胞膜以增强抗旱性。进一步通过酵母单杂交（Y1H）实验验证发现，LpNAC22能特异性结合LpLEA1和LpLEA2-1的启动子片段，并激活LacZ报告基因表达。后续经ChIP-qPCR、EMSA及荧光素酶报告基因实验多维度验证，证实LpNAC22可直接结合上述LEA基因启动子并激活其转录。
图5.LpNAC22直接调控LpLEA1和LpLEA2-1的表达水平。
大量研究表明膜稳定是LEA蛋白响应干旱胁迫的主要机制。本研究发现，干旱处理可诱导LpLEA1和LpLEA2-1表达，且其编码蛋白定位于细胞膜，暗示二者可能在干旱下维持膜完整性。因未能获得过表达这两个基因的转基因多年生黑麦草，故用拟南芥转基因株系分析表型。结果显示，干旱条件下野生型多数萎蔫，而过表达株系存活率更高，离子渗漏率和MDA含量更低。这些结果表明，LpLEA1和LpLEA2-1能减轻细胞膜损伤，增强植株抗旱性。
图6. LpLEA1和LpLEA2-1的过表达可缓解干旱条件下植物细胞膜的损伤。
研究结论
本研究鉴定了多年生黑麦草中的干旱诱导型核转录激活因子LpNAC22，证实其通过直接调控LEA家族基因LpLEA1和LpLEA2-1的表达来增强植物的耐旱性，为多年生黑麦草的耐旱分子育种提供了重要的基因资源和理论依据。
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