Plant Physiol：DAP-seq助力揭示番茄果实成熟调控新机制
2025-06-10 来源:本站 点击次数:166研究背景
番茄是全球广泛种植的作物，其肉质果实富含类胡萝卜素、维生素和酚类化合物，具有重要的经济价值。成熟是一个复杂且受到严格调控的发育过程，会显著改变果实的颜色、质地、风味和香气。这一过程由植物激素和遗传调控因子之间的复杂相互作用驱动。C2H2 型锌指转录因子在植物生长、发育和抗逆性中具有重要作用，但其在果实成熟中的具体功能仍缺乏研究。
文献解读
2025年1月，中国农业大学园艺学院郭仰东/张娜团队在Plant Physiology（IF=6.5）发表了题为“Protein phosphatase PP2C2 dephosphorylates transcription factor ZAT5 and modulates tomato fruit ripening”的研究论文，该研究揭示了SlPP2C2-SlZAT5模块介导的蛋白去磷酸化修饰在调节呼吸跃变型果实成熟中的作用，本文借助DAP-seq技术，在全基因组范围内系统鉴定了SlZAT5的结合位点，筛选出其直接调控的靶基因，解析了SlZAT5的转录调控机制，为改良番茄果实品质提供了理论支撑。
技术路线
研究结果
先前研究发现AdZAT5是猕猴桃果实软化的潜在调节因子。本研究通过系统发育分析，在番茄中找到其同源基因SlZAT5，该基因含两个保守C2H2结构域和EAR基序。RT-qPCR结果表明SlZAT5在番茄各组织均有表达，果实未成熟绿色阶段表达较高、成熟时下降。SlZAT5突变体开花至破口期缩短至约43天，乙烯峰值提前、硬度下降、类胡萝卜素积累高；SlZAT5过表达株系则延长至约47天，乙烯峰值延迟、硬度增加、类胡萝卜素积累低，表明SlZAT5负调控番茄果实成熟。
图1. SlZAT5负调控番茄果实成熟。
为了确定SlZAT5在果实成熟过程中的直接转录靶标，作者通过DAP-seq分析，在7754个基因中检测到SlZAT5结合峰（高可信度区域）。结合RNA-seq数据，筛选出1511个受SlZAT5调控的成熟相关基因，其中包括乙烯合成基因SlACS4、细胞壁降解基因SlPL8和转录因子基因SlGRAS38等关键基因，这些基因的启动子区域均有SlZAT5结合位点富集。进一步通过RT-qPCR、Y1H、Dual-Luc、ChIP-qPCR和EMSA多种实验证实，SlZAT5可直接结合上述基因启动子并抑制其表达。研究表明SlZAT5通过结合关键基因启动子调控果实成熟过程。
图2. SlZAT5直接抑制与成熟相关的基因表达。
为进一步探究SlZAT5在果实成熟中的作用，作者通过Y2H文库筛选，鉴定出其互作蛋白SlPP2C2。同时通过BiFC、LCI、蛋白pull-down、Co-IP、蛋白亚细胞共定位多种实验，证实了二者的相互作用，且发生在细胞核内。通过酵母转录激活实验及原生质体报告系统发现，SlZAT5全长及含EAR基序的C端截短片段均无转录激活活性，但可抑制荧光素酶活性，表明其作为转录抑制因子发挥功能。以上结果明确了SlZAT5与SlPP2C2的互作关系及SlZAT5的转录抑制特性。
图3. 转录抑制因子SlZAT5与SlPP2C2存在物理相互作用。
通过RT-qPCR检测SlPP2C2在不同组织和果实成熟阶段的表达，发现其在果实未成熟绿色（IMG）和成熟绿色（MG）阶段高表达，随成熟进程下降。研究构建了Slzat5、Slpp2c2和Slzat5-Slpp2c2突变体：Slpp2c2突变体果实成熟加速，乙烯水平、类胡萝卜素含量升高，硬度和叶绿素含量降低。Slzat5-Slpp2c2双突变体，经水处理果实成熟更快；而经乙烯、ACC和1-MCP处理，突变体与野生型的表型无明显差异。结果表明SlZAT5和SlPP2C2通过调控乙烯合成控制番茄果实成熟。
图4. SlZAT5和SlPP2C2通过调节乙烯反应来调控番茄果实的成熟。
为探究SlZAT5是否受SlPP2C2翻译后修饰，通过WB检测发现，SlZAT5过表达样本中存在SlZAT5蛋白及其磷酸化形式，经磷酸酶处理后磷酸化信号消失；SlPP2C2-GFP与SlZAT5-MYC共表达时，未检测到磷酸化条带。进一步通过LC-MS/MS分析，确定了Ser-65为磷酸化位点。双荧光素酶报告实验表明，SlZAT5及去磷酸化突变体S65A可抑制下游基因活性，而磷酸化突变体S65D无此作用。此外，敲除SlPP2C2显著上调目标基因转录水平。以上结果表明，SlPP2C2通过去磷酸化SlZAT5的Ser-65位点，调控其对下游成熟相关基因的转录抑制活性。
图5. SlPP2C2对SlZAT5去磷酸化作用对SlZAT5转录活性的影响。
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