蛋白互作研究全攻略：常用方法+避坑指南
2025-06-30 来源:本站 点击次数:57在生命微观尺度下，蛋白质是极为关键的生物大分子，广泛参与细胞结构维系、物质转运、新陈代谢催化、信号传导调控等生命活动，是生命活动的重要基石。蛋白质功能的发挥依赖蛋白质-蛋白质相互作用（PPI），PPI参与细胞内众多生理过程，如基因表达调控、信号传导调控等。以信号传导为例，细胞接收信号后通过蛋白质间有序的相互作用传递放大信号，引发生理响应，因此PPI是细胞正常生理功能实现的核心机制，异常时易引发多种疾病。探究其作用机制和规律是生命科学领域的重要课题。
蛋白质相互作用可以分为稳定相互作用和瞬时相互作用两种类型。这两种类型的相互作用均存在强弱差异。
稳定相互作用主要存在于多亚基复合物中，这类相互作用可通过免疫共沉淀或Pull down等方法鉴定。
瞬时相互作用参与细胞内蛋白质修饰、运输、折叠、信号传导、细胞周期等多数生理过程，通常作为生理过程的“分子开关”发挥临时调控作用，其结合强度可强可弱、作用时间可长可短，但一般需要特定条件触发。瞬时相互作用可通过交联或标记转移等方法来检测。
接下来我们一起了解在生命科学研究中检测蛋白间相互作用的常用方法。
一、酵母双杂交（Y2H）
（一）技术简介
酵母双杂交技术是蛋白互作研究的经典方法，起源于20世纪80年代末。它利用酵母转录因子（如GAL4）的结构特征检测蛋白互作——这类转录因子通常由DNA结合结构域（BD）和转录激活结构域（AD）组成，仅当二者空间靠近时才能激活报告基因转录。在该系统中，将待检测的两种蛋白分别与BD、AD融合，构建成诱饵蛋白（BD-靶蛋白）和猎物蛋白（AD-待测蛋白）并导入酵母细胞表达。若两种蛋白发生互作，BD与AD将在空间上靠近，使BD结合到报告基因上游的激活序列（UAS），同时AD激活下游报告基因（如HIS3、LEU2等营养缺陷型基因或β-半乳糖苷酶基因）的转录。通过观察酵母在营养缺陷培养基上的生长情况，或检测β-半乳糖苷酶的显色活性（如X-Gal染色），即可判断蛋白间是否存在互作。
蛋白质相互作用可以分为稳定相互作用和瞬时相互作用两种类型。这两种类型的相互作用均存在强弱差异。
稳定相互作用主要存在于多亚基复合物中，这类相互作用可通过免疫共沉淀或Pull down等方法鉴定。
瞬时相互作用参与细胞内蛋白质修饰、运输、折叠、信号传导、细胞周期等多数生理过程，通常作为生理过程的“分子开关”发挥临时调控作用，其结合强度可强可弱、作用时间可长可短，但一般需要特定条件触发。瞬时相互作用可通过交联或标记转移等方法来检测。
接下来我们一起了解在生命科学研究中检测蛋白间相互作用的常用方法。
一、酵母双杂交（Y2H）
（一）技术简介
酵母双杂交技术是蛋白互作研究的经典方法，起源于20世纪80年代末。它利用酵母转录因子（如GAL4）的结构特征检测蛋白互作——这类转录因子通常由DNA结合结构域（BD）和转录激活结构域（AD）组成，仅当二者空间靠近时才能激活报告基因转录。在该系统中，将待检测的两种蛋白分别与BD、AD融合，构建成诱饵蛋白（BD-靶蛋白）和猎物蛋白（AD-待测蛋白）并导入酵母细胞表达。若两种蛋白发生互作，BD与AD将在空间上靠近，使BD结合到报告基因上游的激活序列（UAS），同时AD激活下游报告基因（如HIS3、LEU2等营养缺陷型基因或β-半乳糖苷酶基因）的转录。通过观察酵母在营养缺陷培养基上的生长情况，或检测β-半乳糖苷酶的显色活性（如X-Gal染色），即可判断蛋白间是否存在互作。
（二）实验注意事项
1. 在构建载体时，要确保融合蛋白的正确表达，避免因基因插入错误或表达异常导致实验失败；
2. 要对诱饵蛋白进行自激活检测，防止其自身激活报告基因，产生假阳性结果；
3. 在筛选文库时，要设置合适的对照，如阳性对照和阴性对照，以准确判断实验结果；
4. 由于酵母细胞的生长状态对实验结果有影响，所以要保证酵母感受态细胞的质量，操作过程也要严格按照无菌要求进行，防止杂菌污染。
（三）优势与局限
▶优势：
1. 高通量筛选能力：可从 cDNA 文库（含数万克隆）中大规模筛选互作蛋白，适用构建蛋白质互作网络；
2. 模拟体内环境：在酵母细胞内检测互作，保留蛋白折叠与核定位等生理条件，适合核蛋白互作分析；
3. 操作简便：无需纯化蛋白，通过报告基因（如营养缺陷、显色反应）表型筛选，适合实验室常规应用；
4. 检测直接互作：可鉴定蛋白间的直接相互作用，无需依赖第三方因子（如抗体）。
▶局限：
1. 假阳性/假阴性率高：约30%-50%阳性克隆为非特异性互作（如自激活现象），膜蛋白、分泌蛋白等因无法进入细胞核易漏检；
2. 依赖蛋白表达与定位：核蛋白互作检测效率高，胞质/膜蛋白需进行特殊改造（如使用膜系统酵母双杂交技术）；
3. 无法检测动态互作：报告基因表达需数小时至数天，难以捕捉瞬时/弱互作（如信号通路中的动态结合）；
4. 物种局限性：哺乳动物蛋白可能因糖基化、磷酸化等翻译后修饰差异，可能导致互作失败。
二、免疫共沉淀（Co-IP）
（一）技术简介
免疫共沉淀（Co-IP）是在细胞裂解液体系中验证蛋白质相互作用的技术，能在细胞内天然状态下捕获相互作用的蛋白质。其原理是基于抗体对目标蛋白表位的特异性识别。细胞裂解后，向裂解液加入针对目标蛋白的特异性抗体，抗体与目标蛋白结合形成免疫复合物，再利用能与抗体Fc段特异性结合的介质（如ProteinA/G琼脂糖珠）沉淀免疫复合物。经多次洗涤去除杂质蛋白，最后用Western Blotting分析沉淀所得的蛋白复合物，或者使用质谱检测与目标蛋白相互作用的潜在蛋白。
1. 在构建载体时，要确保融合蛋白的正确表达，避免因基因插入错误或表达异常导致实验失败；
2. 要对诱饵蛋白进行自激活检测，防止其自身激活报告基因，产生假阳性结果；
3. 在筛选文库时，要设置合适的对照，如阳性对照和阴性对照，以准确判断实验结果；
4. 由于酵母细胞的生长状态对实验结果有影响，所以要保证酵母感受态细胞的质量，操作过程也要严格按照无菌要求进行，防止杂菌污染。
（三）优势与局限
▶优势：
1. 高通量筛选能力：可从 cDNA 文库（含数万克隆）中大规模筛选互作蛋白，适用构建蛋白质互作网络；
2. 模拟体内环境：在酵母细胞内检测互作，保留蛋白折叠与核定位等生理条件，适合核蛋白互作分析；
3. 操作简便：无需纯化蛋白，通过报告基因（如营养缺陷、显色反应）表型筛选，适合实验室常规应用；
4. 检测直接互作：可鉴定蛋白间的直接相互作用，无需依赖第三方因子（如抗体）。
▶局限：
1. 假阳性/假阴性率高：约30%-50%阳性克隆为非特异性互作（如自激活现象），膜蛋白、分泌蛋白等因无法进入细胞核易漏检；
2. 依赖蛋白表达与定位：核蛋白互作检测效率高，胞质/膜蛋白需进行特殊改造（如使用膜系统酵母双杂交技术）；
3. 无法检测动态互作：报告基因表达需数小时至数天，难以捕捉瞬时/弱互作（如信号通路中的动态结合）；
4. 物种局限性：哺乳动物蛋白可能因糖基化、磷酸化等翻译后修饰差异，可能导致互作失败。
二、免疫共沉淀（Co-IP）
（一）技术简介
免疫共沉淀（Co-IP）是在细胞裂解液体系中验证蛋白质相互作用的技术，能在细胞内天然状态下捕获相互作用的蛋白质。其原理是基于抗体对目标蛋白表位的特异性识别。细胞裂解后，向裂解液加入针对目标蛋白的特异性抗体，抗体与目标蛋白结合形成免疫复合物，再利用能与抗体Fc段特异性结合的介质（如ProteinA/G琼脂糖珠）沉淀免疫复合物。经多次洗涤去除杂质蛋白，最后用Western Blotting分析沉淀所得的蛋白复合物，或者使用质谱检测与目标蛋白相互作用的潜在蛋白。
（二）实验注意事项
1. 抗体选择：使用高特异性、高亲和力的IP抗体，可通过Western blot预实验检测抗体对目标蛋白的表位识别能力，验证无明显非特异性条带。需根据抗体种属选择匹配的 Protein A/G 介质，避免因Fc段结合效率低导致沉淀失败。
2. 样品制备：使用新鲜细胞或组织（避免反复冻融），根据目标蛋白选择裂解液（如NP-40或RIPA），添加蛋白酶/磷酸酶抑制剂，防止蛋白降解或修饰丢失，裂解后迅速离心取上清，去除细胞碎片。
3. 对照设置：阴性对照：同型IgG或空载体转基因材料；Input对照：验证目标蛋白在样品中表达。
4. 结合条件优化：调整抗体和磁珠/琼脂糖的比例，避免过量抗体导致非特异性结合，优化孵育时间（通常4℃过夜）和温度。
5. 洗涤条件：根据实验调整洗涤缓冲液盐浓度，如用含 Triton X-100的低盐/高盐缓冲液（如PBS+0.1%Triton X-100）梯度洗涤，去除非特异性结合，同时避免强洗涤条件破坏蛋白复合物。
（三）优势与局限
▶优势：
1. 生理相关性强：在细胞内天然状态下检测蛋白互作，保留翻译后修饰（如磷酸化、泛素化）和亚细胞定位信息，更贴近生理环境（区别于体外Pull-down技术）。
2. 样本适用性广：可用于细胞裂解液、组织样本（如冰冻/石蜡切片组织提取液），甚至转基因动物的体液样本，兼容内源蛋白和外源表达蛋白的检测。
3. 操作兼容性高：结合质谱（MS）可筛选未知互作蛋白，构建互作网络，通过WB能特异性验证已知互作蛋白。
▶局限：
1. 间接互作干扰：检测到的蛋白复合物可能是通过第三方因子连接的间接结合，无法直接证明两蛋白的物理结合，需结合体外Pull-down实验或酵母双杂交验证直接互作。
2. 低丰度蛋白限制：对低表达蛋白的敏感性不足，需要增加样本投入量或借助交联剂固定（但可能增加非特异性结合风险）。
3. 抗体依赖性强：抗体质量直接影响结果，可能漏检某些互作（如表位被遮蔽）或产生假阳性（非特异性结合）。
4. 动态互作捕捉难：难以捕获瞬时或弱相互作用（如激酶-底物的短暂结合），需优化孵育时间或使用交联剂（如甲醛）固定。
三、蛋白Pull-down
（一）技术简介
Pull-down实验是体外研究蛋白质相互作用的经典方法，基于亲和层析原理，能捕获并鉴定与目标蛋白（诱饵蛋白）相互作用的其他蛋白。流程为：先将诱饵蛋白与特定标签（如GST、His、Halo、Flag等）融合表达，利用亲和层析纯化融合蛋白，随后，将纯化的融合蛋白通过标签与固相支持物上配体特异性结合（如GST融合蛋白与谷胱甘肽琼脂糖珠结合），形成固定化的诱饵蛋白。然后将含猎物蛋白的细胞裂解液或蛋白溶液，与固定化诱饵蛋白孵育，通过洗去未结合蛋白，捕获具有相互作用的蛋白复合物。最后洗脱分离结合的蛋白复合物，可使用Western Blotting验证已知互作蛋白或质谱分析筛选未知互作蛋白。
1. 抗体选择：使用高特异性、高亲和力的IP抗体，可通过Western blot预实验检测抗体对目标蛋白的表位识别能力，验证无明显非特异性条带。需根据抗体种属选择匹配的 Protein A/G 介质，避免因Fc段结合效率低导致沉淀失败。
2. 样品制备：使用新鲜细胞或组织（避免反复冻融），根据目标蛋白选择裂解液（如NP-40或RIPA），添加蛋白酶/磷酸酶抑制剂，防止蛋白降解或修饰丢失，裂解后迅速离心取上清，去除细胞碎片。
3. 对照设置：阴性对照：同型IgG或空载体转基因材料；Input对照：验证目标蛋白在样品中表达。
4. 结合条件优化：调整抗体和磁珠/琼脂糖的比例，避免过量抗体导致非特异性结合，优化孵育时间（通常4℃过夜）和温度。
5. 洗涤条件：根据实验调整洗涤缓冲液盐浓度，如用含 Triton X-100的低盐/高盐缓冲液（如PBS+0.1%Triton X-100）梯度洗涤，去除非特异性结合，同时避免强洗涤条件破坏蛋白复合物。
（三）优势与局限
▶优势：
1. 生理相关性强：在细胞内天然状态下检测蛋白互作，保留翻译后修饰（如磷酸化、泛素化）和亚细胞定位信息，更贴近生理环境（区别于体外Pull-down技术）。
2. 样本适用性广：可用于细胞裂解液、组织样本（如冰冻/石蜡切片组织提取液），甚至转基因动物的体液样本，兼容内源蛋白和外源表达蛋白的检测。
3. 操作兼容性高：结合质谱（MS）可筛选未知互作蛋白，构建互作网络，通过WB能特异性验证已知互作蛋白。
▶局限：
1. 间接互作干扰：检测到的蛋白复合物可能是通过第三方因子连接的间接结合，无法直接证明两蛋白的物理结合，需结合体外Pull-down实验或酵母双杂交验证直接互作。
2. 低丰度蛋白限制：对低表达蛋白的敏感性不足，需要增加样本投入量或借助交联剂固定（但可能增加非特异性结合风险）。
3. 抗体依赖性强：抗体质量直接影响结果，可能漏检某些互作（如表位被遮蔽）或产生假阳性（非特异性结合）。
4. 动态互作捕捉难：难以捕获瞬时或弱相互作用（如激酶-底物的短暂结合），需优化孵育时间或使用交联剂（如甲醛）固定。
三、蛋白Pull-down
（一）技术简介
Pull-down实验是体外研究蛋白质相互作用的经典方法，基于亲和层析原理，能捕获并鉴定与目标蛋白（诱饵蛋白）相互作用的其他蛋白。流程为：先将诱饵蛋白与特定标签（如GST、His、Halo、Flag等）融合表达，利用亲和层析纯化融合蛋白，随后，将纯化的融合蛋白通过标签与固相支持物上配体特异性结合（如GST融合蛋白与谷胱甘肽琼脂糖珠结合），形成固定化的诱饵蛋白。然后将含猎物蛋白的细胞裂解液或蛋白溶液，与固定化诱饵蛋白孵育，通过洗去未结合蛋白，捕获具有相互作用的蛋白复合物。最后洗脱分离结合的蛋白复合物，可使用Western Blotting验证已知互作蛋白或质谱分析筛选未知互作蛋白。
（二）实验注意事项
1. 蛋白表达纯化：根据需求选择原核（如E.coli，表达需注意蛋白可溶性，避免包涵体形成）或者真核（如HEK293、昆虫细胞等，适合复杂修饰的蛋白）表达系统。
2. 样本制备：裂解液的成分需根据研究对象进行优化，过高浓度的去垢剂可能破坏蛋白-配体的相互作用，样本需充分离心或过滤，去除细胞碎片等杂质。
3. 配体与基质选择：配体的亲和力和特异性直接影响实验结果，需通过预实验筛选最佳配体；基质应选择非特异性吸附低的类型，并严格控制配体的偶联效率和密度。
4. 对照设置：设置阴性对照（如空载表达的蛋白或无关配体），阳性对照（已知与配体结合的蛋白），input对照（同步检测目标蛋白表达量，确保样本制备一致性），以确保实验结果的可靠性。
（三）优势与局限
▶优势：
1. 无需抗体：仅需将诱饵蛋白标记（如GST、His等标签），避免因抗体特异性差或者制备困难导致的实验阻碍，尤其适用于无商业化抗体的蛋白研究。
2. 灵活性高：可精准设计诱饵蛋白的突变体、结构域或翻译后修饰（如磷酸化位点突变），研究结构、修饰等对互作的影响。
3. 样本兼容性广：适用于原核/真核表达蛋白、细胞裂解液、合成多肽（如抗原表位肽），或者化学合成的小分子配体。
4. 应用范围广：可用于研究蛋白质与蛋白质、小分子化合物、核酸等多种配体的相互作用，在药物靶点发现、信号通路机制研究等领域具有重要应用价值。
▶局限：
1. 非特异性背景干扰：配体或基质可能非特异性吸附蛋白，导致假阳性信号。需通过阴性对照（空标签基质）和BSA封闭基质降低背景。
2. 低丰度蛋白检测困难：对于细胞内低表达的蛋白质，由于亲和捕获效率有限，可能难以有效富集，影响检测灵敏度。
3. 无法区分直接与间接相互作用：实验捕获的蛋白复合物中，可能包含与目标蛋白间接结合的蛋白，需要进一步进行点对点实验来验证两蛋白是否直接互作。
4. 动态互作捕捉难：体外孵育时间通常 2-4 小时，无法模拟细胞内瞬时互作（如激酶 - 底物结合仅数秒）。
5. 表达系统限制：原核表达缺乏真核修饰（如糖基化），可能影响互作真实性，可采用无细胞真核表达系统保留翻译后修饰。蓝景科信为您提供无细胞真核表达系统选择，表达成功率高，周期短，表达蛋白更接近体内蛋白情况。
四、双分子荧光互补（BiFC）
（一）技术简介
双分子荧光互补（BiFC）技术能直观、快速地判断目标蛋白在活细胞中的定位和相互作用。其原理是将荧光蛋白（如绿色荧光蛋GFP、黄色荧光蛋YFP 等）在特定位点分割成无荧光活性的N端和C端片段，再将这两个片段分别与待测的两种目标蛋白融合，通过质粒转染或者农杆菌转化导入活细胞表达。当目标蛋白发生相互作用时，会带动两个荧光蛋白片段靠近重组，恢复荧光活性并发光。借助荧光显微镜能直接观测荧光信号在细胞内的位置和强度，从而确定蛋白间的相互关系及其亚细胞定位。
1. 蛋白表达纯化：根据需求选择原核（如E.coli，表达需注意蛋白可溶性，避免包涵体形成）或者真核（如HEK293、昆虫细胞等，适合复杂修饰的蛋白）表达系统。
2. 样本制备：裂解液的成分需根据研究对象进行优化，过高浓度的去垢剂可能破坏蛋白-配体的相互作用，样本需充分离心或过滤，去除细胞碎片等杂质。
3. 配体与基质选择：配体的亲和力和特异性直接影响实验结果，需通过预实验筛选最佳配体；基质应选择非特异性吸附低的类型，并严格控制配体的偶联效率和密度。
4. 对照设置：设置阴性对照（如空载表达的蛋白或无关配体），阳性对照（已知与配体结合的蛋白），input对照（同步检测目标蛋白表达量，确保样本制备一致性），以确保实验结果的可靠性。
（三）优势与局限
▶优势：
1. 无需抗体：仅需将诱饵蛋白标记（如GST、His等标签），避免因抗体特异性差或者制备困难导致的实验阻碍，尤其适用于无商业化抗体的蛋白研究。
2. 灵活性高：可精准设计诱饵蛋白的突变体、结构域或翻译后修饰（如磷酸化位点突变），研究结构、修饰等对互作的影响。
3. 样本兼容性广：适用于原核/真核表达蛋白、细胞裂解液、合成多肽（如抗原表位肽），或者化学合成的小分子配体。
4. 应用范围广：可用于研究蛋白质与蛋白质、小分子化合物、核酸等多种配体的相互作用，在药物靶点发现、信号通路机制研究等领域具有重要应用价值。
▶局限：
1. 非特异性背景干扰：配体或基质可能非特异性吸附蛋白，导致假阳性信号。需通过阴性对照（空标签基质）和BSA封闭基质降低背景。
2. 低丰度蛋白检测困难：对于细胞内低表达的蛋白质，由于亲和捕获效率有限，可能难以有效富集，影响检测灵敏度。
3. 无法区分直接与间接相互作用：实验捕获的蛋白复合物中，可能包含与目标蛋白间接结合的蛋白，需要进一步进行点对点实验来验证两蛋白是否直接互作。
4. 动态互作捕捉难：体外孵育时间通常 2-4 小时，无法模拟细胞内瞬时互作（如激酶 - 底物结合仅数秒）。
5. 表达系统限制：原核表达缺乏真核修饰（如糖基化），可能影响互作真实性，可采用无细胞真核表达系统保留翻译后修饰。蓝景科信为您提供无细胞真核表达系统选择，表达成功率高，周期短，表达蛋白更接近体内蛋白情况。
四、双分子荧光互补（BiFC）
（一）技术简介
双分子荧光互补（BiFC）技术能直观、快速地判断目标蛋白在活细胞中的定位和相互作用。其原理是将荧光蛋白（如绿色荧光蛋GFP、黄色荧光蛋YFP 等）在特定位点分割成无荧光活性的N端和C端片段，再将这两个片段分别与待测的两种目标蛋白融合，通过质粒转染或者农杆菌转化导入活细胞表达。当目标蛋白发生相互作用时，会带动两个荧光蛋白片段靠近重组，恢复荧光活性并发光。借助荧光显微镜能直接观测荧光信号在细胞内的位置和强度，从而确定蛋白间的相互关系及其亚细胞定位。
（二）实验注意事项
1. 载体设计优化：在目标蛋白与荧光片段之间添加柔性连接肽，通过增加空间自由度减少荧光片段对蛋白互作的位阻效应，避免干扰蛋白功能。
2. 表达水平控制：低转染量减少假阳性，平衡两种蛋白表达效率。
3. 严格对照：设单独片段对照，排除片段自发互补的可能，添加阴性和阳性对照。
4. 检测条件：荧光信号通常在转染后12-24小时开始出现，因荧光蛋白重构需要折叠时间，建议在24-48小时内完成成像，避免超过72小时因蛋白过饱和聚集产生假阳性，针对不同荧光蛋白设置合适激发/发射波长。
（三）优势与局限
▶优势：
1. 直观可视化：通过荧光显微镜（如共聚焦）实时观测蛋白互作的亚细胞定位（如细胞膜、细胞核、细胞质囊泡等），直接关联互作事件与细胞功能区域。
2. 高特异性：仅当两蛋白距离<10 nm时，荧光蛋白N/C端片段才能重构成完整β-barrel构并恢复荧光，降低假阳性。
3. 适用于弱/瞬时互作：荧光互补后形成稳定发色团，可将短暂互作（如激酶-底物结合数秒）转化为持续荧光信号，通过累计效应提升检测灵敏度。
4. 多系统兼容：动物细胞、植物细胞及模式生物体内均可应用，适用于原生质体、组织切片及活体幼体等多种样本类型。
5. 多色扩展应用：利用不同光谱的荧光蛋白（如GFP/YFP/CFP/RFP），通过光谱拆分技术实现2-3对互作的同时可视化分析。
▶局限：
1. 不可逆互补：荧光蛋白互补后形成共价或非共价稳定结构，无法反映动态解离过程。
2. 假阳性风险：过表达可能导致蛋白非生理性聚集或片段自发互补（需单转片段对照）。
3. 灵敏度限制：弱互作可能信号微弱，需搭配高灵敏度设备（如共聚焦显微镜）或信号放大系统（如mCherry标签串联）。
4. 蛋白构像干扰：荧光蛋白片段插入可能影响目标蛋白的折叠或亚细胞定位。
5. 光稳定性问题：常用荧光蛋白（GFP/YFP）在高强度光照下易发生光漂白（半衰期约 5-10 分钟），需采用低光强成像+快速扫描或添加抗淬灭剂。
五、荧光素酶互补（LCI）
（一）技术简介
荧光素酶互补实验基于荧光素酶的特性来检测蛋白质的相互作用。原理是将荧光虫荧光素酶（如Firefly luciferase）拆分成两个无活性的N端和C端片段，再分别与待检测的两种目标蛋白融合表达。当目标蛋白发生相互作用时，两个荧光素酶片段靠近重构为有活性的酶，再加入荧光素底物可催化底物反应产生生物发光信号，通过检测发光信号强度即可判断蛋白间是否存在相互作用及作用强度。
1. 载体设计优化：在目标蛋白与荧光片段之间添加柔性连接肽，通过增加空间自由度减少荧光片段对蛋白互作的位阻效应，避免干扰蛋白功能。
2. 表达水平控制：低转染量减少假阳性，平衡两种蛋白表达效率。
3. 严格对照：设单独片段对照，排除片段自发互补的可能，添加阴性和阳性对照。
4. 检测条件：荧光信号通常在转染后12-24小时开始出现，因荧光蛋白重构需要折叠时间，建议在24-48小时内完成成像，避免超过72小时因蛋白过饱和聚集产生假阳性，针对不同荧光蛋白设置合适激发/发射波长。
（三）优势与局限
▶优势：
1. 直观可视化：通过荧光显微镜（如共聚焦）实时观测蛋白互作的亚细胞定位（如细胞膜、细胞核、细胞质囊泡等），直接关联互作事件与细胞功能区域。
2. 高特异性：仅当两蛋白距离<10 nm时，荧光蛋白N/C端片段才能重构成完整β-barrel构并恢复荧光，降低假阳性。
3. 适用于弱/瞬时互作：荧光互补后形成稳定发色团，可将短暂互作（如激酶-底物结合数秒）转化为持续荧光信号，通过累计效应提升检测灵敏度。
4. 多系统兼容：动物细胞、植物细胞及模式生物体内均可应用，适用于原生质体、组织切片及活体幼体等多种样本类型。
5. 多色扩展应用：利用不同光谱的荧光蛋白（如GFP/YFP/CFP/RFP），通过光谱拆分技术实现2-3对互作的同时可视化分析。
▶局限：
1. 不可逆互补：荧光蛋白互补后形成共价或非共价稳定结构，无法反映动态解离过程。
2. 假阳性风险：过表达可能导致蛋白非生理性聚集或片段自发互补（需单转片段对照）。
3. 灵敏度限制：弱互作可能信号微弱，需搭配高灵敏度设备（如共聚焦显微镜）或信号放大系统（如mCherry标签串联）。
4. 蛋白构像干扰：荧光蛋白片段插入可能影响目标蛋白的折叠或亚细胞定位。
5. 光稳定性问题：常用荧光蛋白（GFP/YFP）在高强度光照下易发生光漂白（半衰期约 5-10 分钟），需采用低光强成像+快速扫描或添加抗淬灭剂。
五、荧光素酶互补（LCI）
（一）技术简介
荧光素酶互补实验基于荧光素酶的特性来检测蛋白质的相互作用。原理是将荧光虫荧光素酶（如Firefly luciferase）拆分成两个无活性的N端和C端片段，再分别与待检测的两种目标蛋白融合表达。当目标蛋白发生相互作用时，两个荧光素酶片段靠近重构为有活性的酶，再加入荧光素底物可催化底物反应产生生物发光信号，通过检测发光信号强度即可判断蛋白间是否存在相互作用及作用强度。
（二）实验注意事项
1. 载体设计优化：在目标蛋白与荧光素酶片段之间添加柔性连接肽，通过增加空间自由度减少位阻效应，避免干扰蛋白功能。
2. 表达水平控制：低转染量减少假阳性，平衡两种蛋白表达效率。
3. 严格对照：设单独片段对照，排除片段自发互补的可能，添加阴性和阳性对照。
4. 检测条件：荧光信号通常在转染后12-24小时开始出现，因荧光蛋白重构需要折叠时间，建议在24-48小时内完成成像，避免超过72小时因蛋白过饱和聚集产生假阳性。发光信号半衰期约30分钟，需在添加底物后5-10分钟内完成检测，并设置复孔（n≥3）降低误差。
（三）优势与局限
▶优势：
1. 高灵敏度：可检测弱或瞬时互作（如NanoLuc信号强度比Firefly高100倍）。
2. 定量性强：化学发光信号线性达7-8个数量级，适用于定量分析互作亲和力及药物对互作的抑制/激活效应）。
3. 活细胞/体内应用：适用于植物（如烟草叶片瞬时表达） 和动物模型（如小鼠肿瘤细胞活体成像）。
4. 无自发荧光干扰：生物发光无需激发光，避免细胞自发荧光（如叶绿素、胶原蛋白）和荧光蛋白的光漂白问题。
▶局限：
1. 不可逆互补：荧光素酶片段互补后形成稳定的催化构象，解离半衰期>24小时，无法反映生理条件下的动态解离过程（如激酶-底物的互作）。
2. 过表达假阳性：高浓度蛋白可能导致非生理性聚集（需控制表达量并验证内源互作，设置单转片段对照）。
3. 蛋白构像干扰：荧光素酶片段融合可能影响目标蛋白的折叠或亚细胞定位。
4. 光稳定性问题：发光信号在添加底物后30分钟内衰减50%（如萤火虫荧光素酶），需在5-15分钟内完成检测，不适合长时间互作追踪。
六、表面等离子共振（SPR）
（一）技术简介
SPR是一种基于光学原理的无标记生物分子相互作用分析技术，核心原理是：
当一束偏振光以临界角入射到玻璃棱镜与金属膜（通常为金膜）的界面时，会发生全反射并产生消逝波。若金属膜表面固定的靶分子（如受体、抗体）与溶液中的分析物（如配体、抗原）发生结合，会引起金属膜表面的折射率变化，进而导致反射光的共振角偏移。通过监测共振角偏移量（ΔRU，响应单位），可实时定量分析分子间的结合/解离动力学过程及亲和力强弱。
1.核心组件
1. 载体设计优化：在目标蛋白与荧光素酶片段之间添加柔性连接肽，通过增加空间自由度减少位阻效应，避免干扰蛋白功能。
2. 表达水平控制：低转染量减少假阳性，平衡两种蛋白表达效率。
3. 严格对照：设单独片段对照，排除片段自发互补的可能，添加阴性和阳性对照。
4. 检测条件：荧光信号通常在转染后12-24小时开始出现，因荧光蛋白重构需要折叠时间，建议在24-48小时内完成成像，避免超过72小时因蛋白过饱和聚集产生假阳性。发光信号半衰期约30分钟，需在添加底物后5-10分钟内完成检测，并设置复孔（n≥3）降低误差。
（三）优势与局限
▶优势：
1. 高灵敏度：可检测弱或瞬时互作（如NanoLuc信号强度比Firefly高100倍）。
2. 定量性强：化学发光信号线性达7-8个数量级，适用于定量分析互作亲和力及药物对互作的抑制/激活效应）。
3. 活细胞/体内应用：适用于植物（如烟草叶片瞬时表达） 和动物模型（如小鼠肿瘤细胞活体成像）。
4. 无自发荧光干扰：生物发光无需激发光，避免细胞自发荧光（如叶绿素、胶原蛋白）和荧光蛋白的光漂白问题。
▶局限：
1. 不可逆互补：荧光素酶片段互补后形成稳定的催化构象，解离半衰期>24小时，无法反映生理条件下的动态解离过程（如激酶-底物的互作）。
2. 过表达假阳性：高浓度蛋白可能导致非生理性聚集（需控制表达量并验证内源互作，设置单转片段对照）。
3. 蛋白构像干扰：荧光素酶片段融合可能影响目标蛋白的折叠或亚细胞定位。
4. 光稳定性问题：发光信号在添加底物后30分钟内衰减50%（如萤火虫荧光素酶），需在5-15分钟内完成检测，不适合长时间互作追踪。
六、表面等离子共振（SPR）
（一）技术简介
SPR是一种基于光学原理的无标记生物分子相互作用分析技术，核心原理是：
当一束偏振光以临界角入射到玻璃棱镜与金属膜（通常为金膜）的界面时，会发生全反射并产生消逝波。若金属膜表面固定的靶分子（如受体、抗体）与溶液中的分析物（如配体、抗原）发生结合，会引起金属膜表面的折射率变化，进而导致反射光的共振角偏移。通过监测共振角偏移量（ΔRU，响应单位），可实时定量分析分子间的结合/解离动力学过程及亲和力强弱。
1.核心组件
2. 关键技术参数
响应单位（RU）：1RU≈1ng/mm² 的分子质量变化，反映结合分子的量。
动力学参数：
结合相（Association）：分析物与靶分子结合的速率（kon，单位：M⁻¹・s⁻¹）。
解离相（Dissociation）：结合复合物解离的速率（koff，单位：s⁻¹）。
平衡解离常数（KD）：反映亲和力，KD越小，亲和力越强（如KD<10−9M为高亲和力）。
检测范围：可检测低至nM级的亲和力（如瞬时互作）和快至秒级的动力学过程。
（二）实验注意事项
1. 在固定配体时，要保证配体的活性和固定的稳定性，避免配体在实验过程中脱落或失活。同时，要优化样品的浓度和流速，以获得最佳的信号响应 。
2. 由于SPR信号容易受到外界环境因素的影响，如温度、溶液中的杂质等，所以实验过程中要保持环境的稳定，使用高质量的缓冲液和纯净的样品。
3. 在数据分析时，要选择合适的拟合模型，根据实验目的和数据特点进行参数计算，避免因模型选择不当导致结果偏差 。
（三）优势与局限
▶优势：
1. 无标记：无需荧光/同位素标记，保留分子天然构象。
2. 实时动态：直接监测结合-解离全过程，提供动力学参数。
3. 高灵敏度：可检测低至pg级的分子结合（如单克隆抗体）。
4. 高通量：搭配自动进样器可实现批量样品分析。
▶局限：
1. 需纯化分子：靶蛋白和分析物需高度纯化（不适用于细胞裂解液等复杂体系）。
2. 仪器成本高：商用SPR设备（如Biacore系列）价格通常在百万级别。
3. 固定效应：靶蛋白固定可能影响其构象，导致假阴性 / 假阳性结果。
响应单位（RU）：1RU≈1ng/mm² 的分子质量变化，反映结合分子的量。
动力学参数：
结合相（Association）：分析物与靶分子结合的速率（kon，单位：M⁻¹・s⁻¹）。
解离相（Dissociation）：结合复合物解离的速率（koff，单位：s⁻¹）。
平衡解离常数（KD）：反映亲和力，KD越小，亲和力越强（如KD<10−9M为高亲和力）。
检测范围：可检测低至nM级的亲和力（如瞬时互作）和快至秒级的动力学过程。
（二）实验注意事项
1. 在固定配体时，要保证配体的活性和固定的稳定性，避免配体在实验过程中脱落或失活。同时，要优化样品的浓度和流速，以获得最佳的信号响应 。
2. 由于SPR信号容易受到外界环境因素的影响，如温度、溶液中的杂质等，所以实验过程中要保持环境的稳定，使用高质量的缓冲液和纯净的样品。
3. 在数据分析时，要选择合适的拟合模型，根据实验目的和数据特点进行参数计算，避免因模型选择不当导致结果偏差 。
（三）优势与局限
▶优势：
1. 无标记：无需荧光/同位素标记，保留分子天然构象。
2. 实时动态：直接监测结合-解离全过程，提供动力学参数。
3. 高灵敏度：可检测低至pg级的分子结合（如单克隆抗体）。
4. 高通量：搭配自动进样器可实现批量样品分析。
▶局限：
1. 需纯化分子：靶蛋白和分析物需高度纯化（不适用于细胞裂解液等复杂体系）。
2. 仪器成本高：商用SPR设备（如Biacore系列）价格通常在百万级别。
3. 固定效应：靶蛋白固定可能影响其构象，导致假阴性 / 假阳性结果。
蛋白互作不同方法的比较
上述介绍了6种常用的蛋白质互作研究方法。不同技术的检测原理、实验条件及灵敏度存在差异，可能导致结果不一致。建议根据研究目标（如筛选、验证、定量或定位）和样品特性（如蛋白亚细胞定位、互作强弱），选择单一方法或联合多种技术交叉验证。
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