病毒颗粒的等电位滴定曲线用于指导离子交换层析工艺开发

 

S. Herzer¹, P. Beckett ¹ , T. Wegman ², and P. Moore¹

¹Amersham Biosciences Corp, Piscataway, NJ, USA; ²Mayo Clinic, Rochester, MN, USA

 

    使用电泳滴定曲线（ETC）测定病毒颗粒的电荷性质，是层析纯化法过程中的一个部分。病毒颗粒的CyDye™ 标记和使用Typhoon™扫描仪对其在凝胶中的检测是一种快速且灵敏的工具，可以用于预测完整病毒在离子交换柱上的层析行为。ETC结果有助于离子交换介质和分离条件的选择。 本文报告了腺病毒和麻疹病毒的结果。该方法也适用于腺相关病毒（AAV）、鼠白血病病毒和细菌噬菌体如lambda和M13等。

 

    电泳滴定曲线（ETC）是测定预置的pH范围内生物分子电荷性质的强有力的工具。蛋白质混合物的ETC有大量的参考文献^[1-10] ，并且它们常用于离子交换层析法的评估和预测^{[1, 7]} 。

 

    基因治疗和疫苗对大量高纯度病毒颗粒的要求，使得层析分离纯化倍受关注^[11-14] 。病毒颗粒的复杂性和易碎性影响了实验中对其电荷性质的估计。在pH梯度中的琼脂糖凝胶电泳具有环境相对温和的优点。我们在此描述了一种快速、可重复的、敏感的方法，为进行完整病毒颗粒的层析分离确定一个有用的工作pH。

 

    除特殊说明外，包括细菌噬菌体在内的全部材料都来自Amersham Biosciences公司。制备缓冲液的一般化学药品都来自Sigma, Aldrich。SYPRO™ Ruby来自Molecular Probes。所有其他的病毒都来自ATCC，麻疹病毒除外(由Rochester, MN  梅奥诊所的M. Federspiel教授友好捐赠）。

 

方法

    CyDye™荧光标记在能保持病毒稳定性的弱碱性pH环境中完成。 为避免过度标记和交联仅使用单活性基染料。标记环境保持在低的温度(在冰上）或在短时间内进行，以确保病毒颗粒的表面电荷性质不被过度标记所影响。

 

    其他的步骤都按照制造厂家的说明书进行，除非另有说明。琼脂糖ETC凝胶中加入5%甘油以防止发生凝集，这种凝集在被扫描的凝胶上显示为大片弥散。

 

    按照如下程序在PhastSystem™快速凝胶电泳仪上运行琼脂糖ETC凝胶：第一步，以2000V,20 mA/gel , 15 , 7 W ℃ 经110Vh，以形成pH梯度；在110 Vh时停止电泳，将凝胶旋转90°。在第一步和第二步期间仔细标记阴极的方向。 应用只包含完整的除去盐分的病毒颗粒或细胞溶解产物的样本，使用跨过凝胶的宽度和pH梯度的滴定曲线点样器或小的切口加样。病毒样本在1000V 20 mA/gel, 15 , 7 W ℃ ，经40-60Vh被电荷/pH所分离。经适当设置的Typhoon扫描仪间隔扫描分离的过程。

 

    按照制造厂家的说明书控制琼脂糖ETC凝胶在快速电泳仪上运行，并在Typhoon扫描仪上用SYPRO Ruby观察。

 

    层析法使用HiTrap™ IEX Selection Kit, RESOURCE™ S和  RESOURCE Q柱分离病毒颗粒。选择根据ETC确定的pH值用于分离，将除盐的或稀释的病毒（在> 5 mS/cm时，适当的pH值) 用平衡好的层析柱分离。一般而言，在低强度缓冲液（缓冲液A，如适当pH值的25-50mM Tris)中平衡柱子，用1-3倍柱体积(CV)的病毒上样。

 

    至少1-2倍CV洗柱，再以10倍CV缓冲液A和梯度到100%缓冲液B洗脱病毒，此处缓冲液B包含适当的盐分以确保病毒稳定，例如1M NaCl （需要考虑兼容性）。自始至终按照0.25-0.5CV收集组分。

 

    根据病毒的传染性或利用Sepharose™6 Fast Flow(17-0159-01) 的Triccorn 5/10柱或MicroSpin™ S-400 HR Column (27-5140-01)分析收集的组分。用凝胶电泳分析收集的外水体积以确定病毒结合特性。

 

结果和讨论

    为确保CyDye标记不对病毒电荷行为产生较大影响，已检验过的两种病毒载体在未标记之前也在琼脂糖ETC上分离。凝胶被染色^[15]，并且在迁移模式上仅观察到有轻度的改变（数据未列出）。

 

    以Cy™5标记的腺病毒(AV)的琼脂糖凝胶电泳表明，AV在pH值从5至10的范围内整体来说表面带负电荷，而在pH低于5时带正电荷（图1）。这与组成腺病毒的六联体、五联体和纤维蛋白的等电点相一致^[16]。为确定有助于纯化的pH范围，也采用电泳法将未标记的原材料分离出来，并以SYPRO Ruby染色（数据未列出）。

 

    在pH值为8的Q Sepharose XL上能从粗培养液中将病毒分离出来（图2）。可以使用较低的pH值；然而，结合能力将受影响。

 

    在pH为8时，缓冲液A中能使用达300 mM的NaCl，但是这样与在缓冲液A中无NaCl时进行的分离相比，柱子的结合能力会降低一半（数据未列出)。

 

 

图1、腺病毒标记的Cy5在2%琼脂糖

IEF凝胶、pH梯度为3-10中的琼脂糖

凝胶电泳图。阴离子和阳离子交换（分

别为AIX、CIX）的等电位点及可能的

pH范围如图所示。

 

 

 

 

 

 

 

检测波长：  260 和 280 nm

 

 

 

图2、采用阴离子交换对细胞裂解产物中的腺病毒进行分离。上样前采用Benzonase™核酸内切酶处理裂解物。箭头为腺病毒峰。其纯度与采用CsCl离心处理的两次纯化相当。

 

图3、紫外线灭活Cy3标记麻疹病毒

在2%琼脂糖凝胶、pH梯度为3-10

中的分离，pI，pH值和上样槽如图

所示。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

图4、采用ETC在pH范围为3-9的

IEF凝胶中对病毒样本进行的分析。

凝胶采用SYPRO Ruby染色， 采

用Typhoon扫描仪对电泳带进行

检测。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

    使用毛细管等电聚焦分析5型AV的稳定性已被描述^[17] 。然而，这是首次被描述的使用电泳滴定曲线测定完整病毒颗粒的电荷行为。

 

    也采用ETC对经320nm紫外线照射15分钟灭活的麻疹病毒进行了分析。琼脂糖凝胶电泳曲线证实在PH值低于7时病毒带正电荷，在pH值高于7时带负电荷（图3）。然而，在pH值高于7时，持续存在严重的聚集问题。根据在PH值高于7时对未灭活的麻疹病毒进行的实验，聚集问题看似是常见的，并且不是由于紫外线照射处理所致。然而，紫外线交联可能增加聚集。

 

    根据ETC的结果，选择阳离子交换法分离麻疹病毒。该方法选择也通过污染物的电泳分析法证实，电泳分析法证实大量污染物在pH > 5.5时带负电荷（图4）。这有点意外，因为麻疹病毒两种包膜蛋白的等电点表明该病毒在pH值高于5.5时应该是带负电荷^[18-20] 。这些观察结果表明以经验为主而不是基于蛋白质序列或个别蛋白质等电点来确定电荷性质的有用性。在此基础上，选用pH值为6.5的条件，SP Sepharose XL成功的纯化了麻疹病毒（图5）。 

 

    离子交换层析也可应用于腺相关病毒(AAV)、鼠白血病病毒和细菌噬菌体如lambda  和M13的纯化（数据未列出）。AAV的分析表明：在pH值高于7时，整体净电荷为负，并且在低于中性pH时整体净电荷为正。污染物在pH为5-5.5以上时看似像带负电荷。使用SP Sepharose High Performance从细胞溶解产物中纯化AAV，再利用SOURCE™ 30 Q精细纯化纯化效果较好[21]。  

 

    莫洛尼小鼠白血病病毒在pH高于6时表现出整体净负电荷，在pH低于6时为净正电荷。这与已描述的表面蛋白的等电点相一致(22–25)。在高于和低于那个pH时，电荷以快速增加的偏移速度急剧转换。污染物看似在pH值为5–5.5以上时也是主要带负电荷，然而，在5.5–8的pH值范围内电荷轻度增加。RESOURCE Q上的阴离子交换层析用于分离MLV与它的主要污染物（数据未列出）。

 

检测波长：260 和 280 nm

 

 

 

 

图5、在pH 6.5下在SP Sepharose XL中对紫外线灭活麻疹病毒所进行的分离。 黑线所示为含有病毒的组分（基于凝胶过滤分析数据）。 

 

    电泳滴定曲线是一种用于初步筛选病毒颗粒的离子交换层析条件的简单、快速的方法。此处描述的该方法依靠CyDye标记和使用Typhoon扫描仪观察，用于病毒颗粒的快速和敏感的检测。 如上所述， ETC被用于确定一个适当的pH范围以进行完整病毒颗粒的离子交换层析。在某些情况下，仅能依靠经ETC电泳滴定产生的经验数据来确定适当的pH范围，而已经发表的衣壳蛋白质的等电点并不适用于确定病毒纯化条件。

 

 

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