Sapphire激光扫描系统磷屏成像在助力肺纤维化无创监控新突破中的应用
2024-07-05 来源:本站 点击次数:1176
肺纤维化疾病由于缺乏可靠的生物标志物进行风险分层和治疗监测，给疾病的精确管理带来挑战。近年来发现，单核细胞来源的巨噬细胞(MDMφ)的积累是促进肺纤维化的关键因素。因此，跟踪MDMφ积累的体内动力学可望用于肺炎纤维化的评估。
近日，匹兹堡大学在Science Advances杂志（IF：13.6）发表了题为“Noninvasive assessment of the lung inflammation-fibrosis axis by targeted imaging of CMKLR1”的文章，研究了cmklr1靶向的PET在小鼠纤维化肺损伤模型中监测MDMφ积累动力学的潜力，并确定了其作为纤维化肺疾病内分型和预后生物标志物的临床相关性。
1 肺纤维化中的巨噬细胞图景
为研究CMKLR1在IPF肺免疫细胞中的作用，作者对两个具有>300,000个免疫细胞的全肺单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据集进行探索分析。按不同表型，巨噬细胞被分为包含Alv-Mφ (FABP4Hi)和FABP4Int-Mφ的肺泡巨噬细胞，以及3组非肺泡巨噬细胞：SPP1- m φ组、FOLR2-Mφ组及罕见的OLFML3-Mφ群体。
2 CMKLR1表达标志新生MDMφ的富集
两个数据集中，CMKLR1表达在巨噬细胞群体中最常被检测到(图1C、D)。FOLR2-Mφ在所有免疫细胞类型中具有最高的检测频率及CMKLR1表达，其次是OLFML3-Mφ， SPP1-Mφ等。
与更严重的下肺叶相比，IPF上肺叶中促纤维化SPP1+巨噬细胞更少。但CMKLR1+巨噬细胞数量在上、下肺叶中同样具有显著升高（IPF上肺叶：8.4%，下肺叶：8.9%；对照组上肺叶：2.3%，下肺叶：0.8%），相比于终末期SPP1+促纤维化巨噬细胞的升高，可作为更可靠的早期生物标志物。
广义加性模型(GAMs)显示，在FOLR2-Mφ和SPP1-Mφ轨迹中，CMKLR1的表达随着单核细胞特征的下降而上升，当促纤维化基因表达开始时达到峰值，后随着促纤维化特征的上升逐渐下降（图1I、J）。表明CMKLR1是新生MDMφ在肺纤维化中富集的标志，可随着巨噬细胞适应纤维化微环境并逐渐下降。
图1. 人类肺部疾病和健康的scRNA-seq分析。(B)按细胞类型标记的细胞UMAP。(C-D) 细胞类型、数据集及疾病间标准化的基因表达UMAP和热图。(I- J) 基因表达的广义加性模型(GAM)拟合为上述每条轨迹的扩散伪时间函数。
3 MDMφ驱动CMKLR1靶向肽的摄取
博莱霉素气管给药后的1、2和4周分别大致对应于肺炎高峰期、持续肺炎的早期ECM重构及炎症消退伴纤维化。为便于流式细胞实验，作者用荧光修饰肽（6CF-CG34）替代NODAGA，合成PET示踪剂[64Cu]NODAGA-CG34的类似物。结果显示，基线期的主要免疫细胞群体为组织驻留的肺泡巨噬细胞，MDMφ忽略不计。1周后， MDMφ显著积累，而肺泡巨噬细胞数量稳定。第2周，MDMφ数量与1周时相似，但后者数量大幅增加，且MDMφ表现出与其愈加相似的表型分化（图2A）。4周后均回落至基线水平。在此期间，肺单核细胞数量相对稳定。
图2. 流式细胞术鉴定驱动CMKLR1靶向肽摄取的细胞。(A)肺泡巨噬细胞、间质巨噬细胞和MDMφ的鉴定。(B)单核细胞和巨噬细胞亚群绝对数量的动力学。(D)单核细胞和巨噬细胞群体对6CF- CG34特异性摄取的定量检测。(E)给药后摄取6CF- CG34的细胞亚群占比。
相应地，最初2周的MDMφ对6CF-CG34的摄取很高，第4周趋于减少（图2C、D）。间质巨噬细胞仅在给药后1周有短暂增加，2周后又恢复至基线水平。而肺泡巨噬细胞和单核细胞在此期间均无显著的6CF-CG34特异性摄取。NK细胞尽管具有显著摄取，但博来霉素诱导损伤后，其丰度及CMKLR1表达均未变化。
此外，在损伤后1周和2周，6CF-CG34的总摄取显著增加，且主要由MDMφ的积累驱动（78%和86%）。4周后降至基线水平，显示了MDMφ丰度及其CMKLR1表达水平的降低。[64Cu]NODAGA-CG34 PET及体外γ计数均得到与上述的一致结果。
4 CMKLR1巨噬细胞浸润的炎性肺区PET
为验证[64Cu]NODAGA-CG34 PET提供的CMKLR1巨噬细胞浸润的炎性肺组织空间图的准确性，作者随后对肺部进行磷屏成像（Sapphire激光扫描系统拍摄），并对CMKLR1和巨噬细胞标志物F4/80进行免疫荧光染色(图5)。体内PET检测的示踪剂摄取与相应的离体磷屏成像之间存在强大的共定位(图5A、B)，证实了示踪剂摄取的无创空间定位的准确性。[64Cu]NODAGA-CG34摄取高的区域与表达CMKLR1的F4/80+巨噬细胞丰富的炎症区域相对应(图5C、D)。可见，[64Cu]NODAGA-CG34 PET可定量监测博莱霉素诱导的纤维化肺损伤各阶段MDMφ募集的空间定位。
图5. 博莱霉素处理小鼠1周后， CMKLR1巨噬细胞浸润的炎性肺区[64Cu]NODAGA-CG34摄取共定位图像(A) PET/CT(B)体外放射自显影（磷屏成像，Sapphire激光扫描成像系统拍摄）(C)苏木精和伊红染色和(D)免疫染色组织
5 PET准确预测肺纤维化程度
进一步纵向研究显示，第1周肺中[64Cu]NODAGA-CG34高摄取的区域与第4周CT检测到的严重纤维化的区域相对应，且摄取量与纤维化程度（羟脯氨酸含量及肺衰减量）相关。而第1周的CT实变与纤维化程度仅为弱相关或不相关。可见，肺损伤早期[64Cu]NODAGA-CG34的摄取可准确预测纤维化严重程度和分布，有效补充CT获得的解剖学信息。
图6. [64Cu]NODAGA-CG34 PET对早期肺纤维化的预测。肺部[64Cu]NODAGA-CG34摄取与第四周羟脯氨酸含量(C)及肺衰减 (D)相关。第1周的CT实变与第4周羟脯氨酸弱相关(E)，与肺衰减无显著相关(F)。
6 CMKLR1有助识别IPF炎性内型
对三个地点的IPF患者纵向队列二次分析显示，与对照组相比，IPF患者支气管肺泡灌洗（BAL）细胞中的CMKLR1表达更高，且呈现明显的异质性。转录组分析显示，CMKLR1高表达患者中，趋化因子/趋化因子受体（如CCL2、CCL7）、细胞因子/细胞因子受体（如IL1R2、IL12RB2）及ECM重塑等炎症相关基因表达上调（图7B），或可助于识别IFP不同炎症内型。
CMKLR1表达具有作为预后生物标志物的潜力，与年龄、性别、研究地点和GAP（性别-年龄生理学）指数无关。CMKLR1表达越高，预后逐渐恶化。
此外，在不同水平GAP指数的患者分层中，CMKLR1表达均显示与生存率的相关性。ROC分析显示，CMKLR1在短期至中期随访期间的预测能力优于GAP评分，可望提供现有临床工具外更丰富的风险分层信息。
图7. CMKLR1高表达可识别炎症性和预后不良的IPF内型。(D)基于CMKLR1表达的Kaplan-Meier生存曲线。(E、F) GAP评分分层后的Kaplan-Meier生存曲线表明，CMKLR1高表达预示着较差的生存。(G、H) CMKLR1表达及GAP评分预测BAL术后死亡率的ROC曲线。
7 CMKLR1在各类纤维化肺病中的表达
作者利用现有的生物库进一步探索分析，发现IPF、结节病、硬皮病、类风湿关节炎和煤矿工人尘肺患者肺中存在表达CMKLR1的白细胞，提供了CMKLR1在各种纤维化肺疾病中表达的组织学证据。但由于移除的肺通常代表终末期的疾病特征，仍需进一步研究来阐明CMKLR1在这些疾病中的特异性表达，及其用于疾病内分型和风险分层的潜在用途。
8 总结与讨论
本研究建立了CMKLR1作为纤维化肺病中富集MDMφ的生物标志物，证明了CMKLR1靶向PET无创监测MDMφ积累和纤维化程度预测的准确性，并显示出其对IPF分子内分型的应用前景。
原文链接：
https://www.science.org/doi/full/10.1126/sciadv.adm9817
近日，匹兹堡大学在Science Advances杂志（IF：13.6）发表了题为“Noninvasive assessment of the lung inflammation-fibrosis axis by targeted imaging of CMKLR1”的文章，研究了cmklr1靶向的PET在小鼠纤维化肺损伤模型中监测MDMφ积累动力学的潜力，并确定了其作为纤维化肺疾病内分型和预后生物标志物的临床相关性。
1 肺纤维化中的巨噬细胞图景
为研究CMKLR1在IPF肺免疫细胞中的作用，作者对两个具有>300,000个免疫细胞的全肺单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据集进行探索分析。按不同表型，巨噬细胞被分为包含Alv-Mφ (FABP4Hi)和FABP4Int-Mφ的肺泡巨噬细胞，以及3组非肺泡巨噬细胞：SPP1- m φ组、FOLR2-Mφ组及罕见的OLFML3-Mφ群体。
2 CMKLR1表达标志新生MDMφ的富集
两个数据集中，CMKLR1表达在巨噬细胞群体中最常被检测到(图1C、D)。FOLR2-Mφ在所有免疫细胞类型中具有最高的检测频率及CMKLR1表达，其次是OLFML3-Mφ， SPP1-Mφ等。
与更严重的下肺叶相比，IPF上肺叶中促纤维化SPP1+巨噬细胞更少。但CMKLR1+巨噬细胞数量在上、下肺叶中同样具有显著升高（IPF上肺叶：8.4%，下肺叶：8.9%；对照组上肺叶：2.3%，下肺叶：0.8%），相比于终末期SPP1+促纤维化巨噬细胞的升高，可作为更可靠的早期生物标志物。
广义加性模型(GAMs)显示，在FOLR2-Mφ和SPP1-Mφ轨迹中，CMKLR1的表达随着单核细胞特征的下降而上升，当促纤维化基因表达开始时达到峰值，后随着促纤维化特征的上升逐渐下降（图1I、J）。表明CMKLR1是新生MDMφ在肺纤维化中富集的标志，可随着巨噬细胞适应纤维化微环境并逐渐下降。
3 MDMφ驱动CMKLR1靶向肽的摄取
博莱霉素气管给药后的1、2和4周分别大致对应于肺炎高峰期、持续肺炎的早期ECM重构及炎症消退伴纤维化。为便于流式细胞实验，作者用荧光修饰肽（6CF-CG34）替代NODAGA，合成PET示踪剂[64Cu]NODAGA-CG34的类似物。结果显示，基线期的主要免疫细胞群体为组织驻留的肺泡巨噬细胞，MDMφ忽略不计。1周后， MDMφ显著积累，而肺泡巨噬细胞数量稳定。第2周，MDMφ数量与1周时相似，但后者数量大幅增加，且MDMφ表现出与其愈加相似的表型分化（图2A）。4周后均回落至基线水平。在此期间，肺单核细胞数量相对稳定。
相应地，最初2周的MDMφ对6CF-CG34的摄取很高，第4周趋于减少（图2C、D）。间质巨噬细胞仅在给药后1周有短暂增加，2周后又恢复至基线水平。而肺泡巨噬细胞和单核细胞在此期间均无显著的6CF-CG34特异性摄取。NK细胞尽管具有显著摄取，但博来霉素诱导损伤后，其丰度及CMKLR1表达均未变化。
此外，在损伤后1周和2周，6CF-CG34的总摄取显著增加，且主要由MDMφ的积累驱动（78%和86%）。4周后降至基线水平，显示了MDMφ丰度及其CMKLR1表达水平的降低。[64Cu]NODAGA-CG34 PET及体外γ计数均得到与上述的一致结果。
4 CMKLR1巨噬细胞浸润的炎性肺区PET
为验证[64Cu]NODAGA-CG34 PET提供的CMKLR1巨噬细胞浸润的炎性肺组织空间图的准确性，作者随后对肺部进行磷屏成像（Sapphire激光扫描系统拍摄），并对CMKLR1和巨噬细胞标志物F4/80进行免疫荧光染色(图5)。体内PET检测的示踪剂摄取与相应的离体磷屏成像之间存在强大的共定位(图5A、B)，证实了示踪剂摄取的无创空间定位的准确性。[64Cu]NODAGA-CG34摄取高的区域与表达CMKLR1的F4/80+巨噬细胞丰富的炎症区域相对应(图5C、D)。可见，[64Cu]NODAGA-CG34 PET可定量监测博莱霉素诱导的纤维化肺损伤各阶段MDMφ募集的空间定位。
5 PET准确预测肺纤维化程度
进一步纵向研究显示，第1周肺中[64Cu]NODAGA-CG34高摄取的区域与第4周CT检测到的严重纤维化的区域相对应，且摄取量与纤维化程度（羟脯氨酸含量及肺衰减量）相关。而第1周的CT实变与纤维化程度仅为弱相关或不相关。可见，肺损伤早期[64Cu]NODAGA-CG34的摄取可准确预测纤维化严重程度和分布，有效补充CT获得的解剖学信息。
6 CMKLR1有助识别IPF炎性内型
对三个地点的IPF患者纵向队列二次分析显示，与对照组相比，IPF患者支气管肺泡灌洗（BAL）细胞中的CMKLR1表达更高，且呈现明显的异质性。转录组分析显示，CMKLR1高表达患者中，趋化因子/趋化因子受体（如CCL2、CCL7）、细胞因子/细胞因子受体（如IL1R2、IL12RB2）及ECM重塑等炎症相关基因表达上调（图7B），或可助于识别IFP不同炎症内型。
CMKLR1表达具有作为预后生物标志物的潜力，与年龄、性别、研究地点和GAP（性别-年龄生理学）指数无关。CMKLR1表达越高，预后逐渐恶化。
此外，在不同水平GAP指数的患者分层中，CMKLR1表达均显示与生存率的相关性。ROC分析显示，CMKLR1在短期至中期随访期间的预测能力优于GAP评分，可望提供现有临床工具外更丰富的风险分层信息。
7 CMKLR1在各类纤维化肺病中的表达
作者利用现有的生物库进一步探索分析，发现IPF、结节病、硬皮病、类风湿关节炎和煤矿工人尘肺患者肺中存在表达CMKLR1的白细胞，提供了CMKLR1在各种纤维化肺疾病中表达的组织学证据。但由于移除的肺通常代表终末期的疾病特征，仍需进一步研究来阐明CMKLR1在这些疾病中的特异性表达，及其用于疾病内分型和风险分层的潜在用途。
8 总结与讨论
本研究建立了CMKLR1作为纤维化肺病中富集MDMφ的生物标志物，证明了CMKLR1靶向PET无创监测MDMφ积累和纤维化程度预测的准确性，并显示出其对IPF分子内分型的应用前景。
原文链接：
https://www.science.org/doi/full/10.1126/sciadv.adm9817
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