盐酸莫西沙星注射液中杂质的检测及结构鉴定

王志英
沃特世科技(上海)有限公司

前言：

莫西沙星(Moxifloxacin)为人工合成的喹诺酮类抗菌药，是一类较新的合成抗菌药。具有抗菌性强、抗菌谱广、不易产生耐药性，并对常见耐药菌有效、半 衰 期 长、不良 反 应 少 等 优 点。临 床 上 用 于 治 疗 呼 吸 系 统 感 染 、生 殖系统感染、皮肤软组织感染等。莫西沙星原研厂家为德国拜耳，其注射剂在中国的专利保护期即将到期，国内也有多个厂家正在进行莫西沙星的仿制。但如今基于药品安全的考虑，仿制药中的有关物质的检测越发引起注意，中国药典上也明确规定，药物中杂质，含量高于0.1%的所有杂质均需对其杂质结构进行鉴别(毒性药物限度则更低)。所 以 ，如 何 高 效 快 速 地 测定药物中的杂质，这一课题逐渐成为药物研究过程中亟待解决的难点。

本文采用沃特世(Waters®)超高效液相色谱飞行时间质谱(ACQUITY UPLC/Xevo G2-S QTof)联用技术对莫西沙星注射液(光照10天)样品中杂质进行分析,采用亚2  µm色谱柱UPLC方 法 ，使 整 个 分 离 时 间 由60分钟缩短至25分钟 ，且 杂 质 得 到 有 效 分 离 ；应 用MassLynx和MetaboLynx软 件 ，自 动 得 到 包 含各个杂质分子量、分子式、及结构信息的杂质列表，使整个杂质鉴定过程高效快速、节省人力。

实验条件：

实验流程：

 图6. 主峰的一级质谱图和二级质谱图

采用MassLynx软件，通过准确的质量数和同位素匹配确定分子式，之后再根据二级碎片质谱对结构进行确认。以主峰为例说明判断分子式的过程，如图7确认分子式。再通过软件MassFragment功能对二级碎片进行自动解析，如图8，可看出，其碎片的精确度也非常好，质量偏差很小。

图7. 通过准确的质量数和同位素分布来确定分子式(以主峰为例）

图8. 通过准确的质量数和同位素分布来确定分子式

使用MetaboLynx对杂质进行自动解析，其解析结果界面如图9，可以自动得到杂质列表，其中包含分子量、分子式、质量偏差、峰面积及其结构信息。软件还自动显示每个杂质在样品中的提取离子流图、在空白中的提取离子流图、一级质谱图和二级质谱图，使杂质的分析更明确。通过此软件可快速得到其整个样品谱图上所有杂质的信息，具体如图10显示。其中从“质量偏差(mDa)”可看出由Xevo G2-S QTof可获得很好的质量精度，其质量偏差在0.8 mDa以内。“杂质与母药关系”一栏，可快速获得其结构的相关信息。如写“Hydroxylation”即“主峰的结构+O”，“Hydroxylation + desaturation ”即“主峰的结构+O-H2”。另外出现如(R_0:-CH2)等“R_”的形式是指软件自动对主峰进行烷基化断裂后的结构(软件已自动给出结构)，如“Hydration-CH2 (R_0:-CH2)”即指“主峰-CH2后的结构再+H2O-CH2”，其结构也已呼之欲出。

图9. MetaboLynx对杂质进行自动解析的界面

图10. 通过软件自动得到的莫西沙星注射液(光照10天)样品杂质列表，包含杂质峰m/z、保留时
间、分子量、分子式、质量偏差、峰面积及具体的结构信息等

客户特别关心的三个大峰紫外谱图中5.93 min、8.60 min、18.68 min的杂质信息如表2。其中5.93 min和8.60 min的峰包含有多个杂质，未完全分开。从图11中，RT 5.93 min的一级质谱图可看出：m/z 187.5981为带了双电荷的分子离子，与m/z 374.1880为同一化合物,且m/z 374.1880的含量较高。图12可以看出，200.5981为带了双电荷的分子离子，与400.1866为同一化合物，此杂质浓度较高。图11、12、13分别列出了这三个色谱峰的一级质谱图、每个杂质组分的二级质谱图及可能的结构。

图11. 紫外谱图中RT 5.93 min峰包含的杂质一级及二级质谱图及可能结构

图12. 紫外谱图中RT 8.60 min峰包含的杂质一级及二级质谱图及可能结构

图13. 紫外谱图中RT 18.68 min峰包含的杂质一级及二级质谱图及可能结构

结论：

本实验将常规HPLC色谱柱检测方法平行转化为亚2 μm的UPLC色谱柱检测，分析时间由60 min缩短至25 min，大大提高分析效率，同时流速由1 mL/min降至0.45 mL/min，节约了溶剂成本。分离度及出峰情况与原谱图保持一致。应用Xevo G2-S QTof能得到最准确的分子量,其杂质质量偏差在0.8 mDa以内，同时利用MeteboLynx智能软件，快速得到包含所有杂质峰m/z、保留时间、分子量、分子式、质量偏差、峰面积及具体结构信息的杂质列表，提取离子流图、一级和二级质谱图等信息，大大节省人力及时间。通过此杂质列表及质谱图可得到杂质的可能结构，再通过MassFragment功能对杂质二级碎片结构进行匹配进而确定杂质结构。从此推断流程可看出，在高效的UPLC、精准的QTof仪器及强大的智能软件帮助下，复杂的杂质结构鉴定工作变得更简单轻松，对人员的经验、资历背景依赖性降低，大大节省人力、物力和时间成本，对于药物的有关物质研究工作起到积极的推动作用。