PCR常见问题及解决方案
2014-09-08 来源:本站 点击次数:2737|
问题 |
可能原因 |
解决方法 |
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无产物或产量低 |
模板浓度偏低或偏高 |
电泳检测模板浓度，调整模板用量 |
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模板降解 |
重新制备；基因组DNA、cDNA应小量分装后低温保存 | |
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模板中含有抑制反应的杂质 |
纯化模板 | |
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引物浓度不足 |
调整引物浓度，特别是针对长片段PCR | |
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引物存在二级结构 |
重新设计引物，避免二级结构；优化退火温度 | |
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引物降解 |
引物应高浓度小量分装，-20℃保存，避免反复冻融 | |
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Mg2+浓度偏低 |
适当提高Mg2+浓度，从1 mM到3 mM以0.5 mM间隔递增，针对不同模板和引物摸索最佳Mg2+浓度 | |
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dNTP降解 |
-20℃保存，小量分装，避免反复冻融 | |
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酶纯度低，扩增效率差 |
选用高质量DNA聚合酶 | |
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酶量不足 |
适当增加酶量 | |
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用酶不当 |
针对模板、目标片段的特选择适当的酶(详见PCR产品选择指南) | |
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缓冲液失效 |
更换缓冲液或使用预混PCR反应体系 | |
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模板变性不充分 |
适当延长变性时间；对高GC或复杂结构模板，提高起始变性温度至98℃ | |
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退火温度偏高 |
降低退火温度，应比引物Tm低至少5℃ | |
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延伸时间不足 |
增加延伸时间，特别是针对长片段PCR | |
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循环数目不够 |
增加循环数 | |
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PCR管污染 |
质量可靠的PCR管通常不需灭菌，否则应先高温高压灭菌处理；用过的PCR管不可清洗后重复使用 | |
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PCR仪故障 |
检查程序和模块温度 | |
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其他 |
使用PCR增强剂 | |
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非特异产物过多 |
体系污染 |
设计对照实验寻找污染源，操作时应注意避免交叉污染 |
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引物浓度过高 |
适当减少引物浓度 | |
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引物序列特异性差 |
重新设计引物 | |
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Mg2+浓度过高 |
降低Mg2+浓度，从1 mM到3 mM以0.5 mM间隔递增，针对不同模板和引物摸索最佳Mg2+浓度 | |
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dNTP浓度过高 |
降低dNTP浓度 | |
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酶量过多 |
减少酶量，以0.5 U间隔递减 | |
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退火温度过低 |
提高退火温度 | |
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延伸时间过短 |
增加延伸时间，以1 min间隔递增 | |
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循环次数过多 |
减少循环次数 | |
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模板结构过于复杂或目标片段过长 |
特选择适当的酶(详见PCR产品选择指南)；使用PCR增强剂 | |
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其他 |
HotStart PCR
TouchDown PCR
巢式PCR | |
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引物二聚体 |
引物3’末端存在互补序列 |
重新设计引物 |
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引物浓度过高 |
降低引物浓度 | |
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模板浓度过低 |
提高模板浓度 | |
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退火温度不合适 |
优化退火温度 | |
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循环次数过多 |
减少循环次数 | |
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其他 |
HotStart PCR | |
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拖尾严重 |
引物浓度过高 |
调整引物浓度 |
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引物序列特异性差或模板上存在同源序列 |
重新设计引物 | |
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模板降解 |
重新制备模板 | |
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模板浓度过高 |
降低模板浓度 | |
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dNTP浓度过高 |
减少dNTP用量 | |
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Mg2+浓度过高 |
降低Mg2+浓度，从1 mM到3 mM以0.5 mM间隔递增，针对不同模板和引物摸索最佳Mg2+浓度 | |
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酶量过多或质量差 |
减少酶量，以0.5 U间隔递减；更换质量可靠的酶 | |
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变性温度过低 |
提高变性温度，以0.5℃递增 | |
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退火温度过低 |
提高退火温度 | |
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延伸时间过长 |
缩短延伸时间 | |
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循环次数过多 |
减少循环次数，以2个循环间隔递减 | |
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体系污染 |
设计对照实验，消除污染源 | |
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其他 |
HotStart PCR
TouchDown PCR
巢式PCR | |
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假阳性 |
目标片段与非特异扩增片段间存在同源性 |
设计阴性对照，确认为引物问题后重新设计引物 |
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体系污染 |
设计阴性对照判断是否有污染，去除污染源 |
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