作者：张坤博士 徕卡显微系统 生命科学部 应用专员

荧光显微镜在研究活细胞中蛋白质分子的定位、相互作用及动力学等生命活动中起着不可或缺的作用。将荧光蛋白如绿色荧光蛋白和目的蛋白融合表达，然后利用荧光蛋白发出的特异性荧光来观察和追踪目的蛋白分子在科学研究中得到了广泛的应用。但是荧光蛋白具有量子产量低、成熟速度受限、光谱容易受到环境因素影响及容易形成聚集体等缺点，这些在一些特殊的显微荧光成像中会造成假象而影响最终的实验结果。因此，科学家们也开始寻找、发明越来越合适的活细胞标记方法，以配合越来越精准的显微成像（如超高分辨率等）技术来更加真实的观察、记录各种微观生命活动。本文中重点介绍了SNAP-tag和SiR等新型标记方法和染料的特征及应用。

SNAP-tag技术简介

图1. SNAP-tag标记示意图。该标记方法具有特异性高、速度快、稳定性高及荧光探针选择灵活多样等优点

如何才能将活细胞中的目的蛋白标记上特异的荧光信号呢？谈到特异性，科学家们首先考虑到的是酶和底物的相互作用。因此，从酶促反应出发，瑞士洛桑理工学院的Kai Johnsson科研小组发现人类DNA修复酶（alkylguanine-DNAalkyltransferase，AGT）可以特异性并快速地与苯甲基鸟嘌呤（benzylguanine, BG）衍生物发生反应，以共价键结合。随后，对AGT进行了突变改造，获得了一种不与DNA链上的鸟嘌呤进行反应的蛋白Snap-tag，该蛋白不再定位于细胞核中，但与小分子BG衍生物的亲和力却大大地提高现在[1-2]。SNAP-tag只有20KDa大小，因此可以将目的蛋白与SNAP-tag融合表达。将带有荧光探针标记的BG导入细胞后，BG与SNAP-tag会快速的发生共价反应，从而实现活细胞中特异性目的蛋白的荧光标记（图1）。科学家可以特异性的选择细胞膜通透性的或非通透性的BG底物，分别用于研究膜表面分子和细胞质内表达的分子[3]。相对于荧光蛋白表达，SNAP-tag标记的最大的优点是荧光探针的灵活选择性，如荧光染料、量子点、金颗粒及光激活、光转换的染料等，目前NEB等公司已经将SNAP-tag的表达载体和这些底物广泛商品化，荧光探针的光谱选择也非常灵活（表1）。鉴于其使用的便捷性，SNAP-tag已经得到了广泛应用，如用于研究蛋白的半衰期、运输及相互作用等[4-6]。Johnsson研究小组通过对SNAP-tag进行改造，获得了一种新的CLIP-tag，经过基因改造，使其不与苄基鸟嘌呤衍生物结合，而与苄基胞嘧啶衍生物（Benzylcytosine, BC）结合[7]。CLIP-tag与SNAP-tag联合使用，能够同时标记同一个细胞中两个不同的蛋白，使这种tag自我标记型的标记方法的应用得到了进一步的拓展[8-11]（表1）。在实际操作中，研究者将荧光标记的底物加入表达SNAP-tag或CLIP-tag的细胞中，待结合完成后清洗几次以去除未结合的荧光底物即可进行成像，非常简单便捷。

表1.目前NEB公司提供的多种多样的SNAP-tag和CLIP-tag底物

SNAP-tag技术在STED超高分辨率显微成像中的应用

近十年中，显微成像技术得到了飞跃的发展，填补光学显微镜（~200 nm）到电子显微镜（~0.1 nm）分辨率缺口，打破光学衍射极限的超高分辨率显微镜也越来越趋于成熟化。其中，德国马普研究所的Stefan Hell教授凭借其研发的受激发射损耗（Stimulatedemission depletion，STED）技术荣获2014年的诺贝尔化学奖。STED超高分辨率显微镜是架构在共聚焦显微镜上，因此其成像速度非常快，可以广泛的应用于活细胞的超高分辨率成像。除了传统的YFP等荧光蛋白可以用于STED活细胞超高分辨率成像，SNAP-tag和CLIP-tag可以非常简便的的将AlexaFluo等有机染料引入活细胞，实现活细胞中多色超高分辨率成像。有机染料具有更好的光稳定性，光谱的选择也更加灵活，配合SNAP-tag和CLIP-tag标记的特异性和稳定性，可以更优秀的服务于长时间的活细胞超高分辨率显微成像。Joerg B等科学家用SNAP-tag/BG-94和CLIP-tag/BC-647分别标记了表皮生长因子受体（EGFR）和表皮生长因子（EGF）（图2），利用STED超高分辨率显微镜解析了两者在活细胞中的相互作用（图3）[12]。

图2.SNAP-tag/BG-494和CLIP-tag/BC-647N分别标记EGFR和EGF的示意图。原则上EGFR和EGF结合后会形成同源二聚体，在这里考虑到示意图的简洁清晰性，EGFR仍然以单体的形式表示。

参考文献：

1.Juillerat, A., Gronemeyer, T., Keppler,A., Gendreizig, S., Pick, H., Vogel, H., and Johnsson, K. (2003). Directedevolution of O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase for efficient labeling offusion proteins with small molecules in vivo. Chem Biol 10, 313-317.

2.Gronemeyer, T., Chidley, C., Juillerat,A., Heinis, C., and Johnsson, K. (2006). Directed evolution ofO6-alkylguanine-DNA alkyltransferase for applications in protein labeling.Protein Eng Des Sel 19, 309-316.

3.Brun, M.A., Griss, R., Reymond, L.,Tan, K.T., Piguet, J., Peters, R.J., Vogel, H., and Johnsson, K. (2011).Semisynthesis of fluorescent metabolite sensors on cell surfaces. J Am Chem Soc133, 16235-16242.

4.Banala, S., Maurel, D., Manley, S., andJohnsson, K. (2012). A caged, localizable rhodamine derivative forsuperresolution microscopy. ACS Chem Biol 7,289-293.

5.Campos, C., Kamiya, M., Banala, S.,Johnsson, K., and Gonzalez-Gaitan, M. (2011). Labelling cell structures andtracking cell lineage in zebrafish using SNAP-tag. Dev Dyn 240, 820-827.

6.Bannwarth, M., Correa, I.R., Sztretye,M., Pouvreau, S., Fellay, C., Aebischer, A., Royer, L., Rois, E., and Johnsson,K. (2009). Indo-1 derivatives for local calcium sensing. ACS Chem Biol 4, 179-190.

7.Gautier, A., Juillerat, A., Heinis, C.,Correa, I.R., Jr., Kindermann, M., Beaufils, F., and Johnsson, K. (2008). Anengineered protein tag for multiprotein labeling in living cells. Chem Biol 15, 128-136.

8.Maurel, D., Comps-Agrar, L., Brock, C.,Rives, M.L., Bourrier, E., Ayoub, M.A., Bazin, H., Tinel, N., Durroux, T.,Prezeau, L., et al. (2008). Cell-surface protein-protein interaction analysiswith time-resolved FRET and snap-tag technologies: application to GPCRoligomerization. Nat Methods 5,561-567.

9.Comps-Agrar, L., Maurel, D., Rondard, P.,Pin, J.P., Trinquet, E., and Prezeau, L. (2011). Cell-surface protein-proteininteraction analysis with time-resolved FRET and snap-tag technologies:application to G protein-coupled receptor oligomerization. Methods Mol Biol 756, 201-214.

10.Feinstein, T.N. (2013). Cell-surfaceprotein-protein interaction analysis with time-resolved FRET and snap-tagtechnologies. Methods Mol Biol 1066,121-129.

11.Lukinavicius, G., Lavogina, D., Orpinell,M., Umezawa, K., Reymond, L., Garin, N., Gonczy, P., and Johnsson, K. (2013).Selective chemical crosslinking reveals a Cep57-Cep63-Cep152 centrosomalcomplex. Curr Biol 23, 265-270.

12.Pellett, P.A., Sun, X., Gould, T.J.,Rothman, J.E., Xu, M.Q., Correa, I.R., Jr., and Bewersdorf, J. (2011).Two-color STED microscopy in living cells. Biomed Opt Express 2, 2364-2371.

关注徕卡显微官方微信：