摘要：目的 研究中药药对虎杖-桂枝对急性痛风性关节炎的影响。方法  取雄性 SD 大鼠 48 只，随机分为 6组（每组 8 只），即正常对照组，模型组，秋水仙碱组（0.1 g·kg-）1，虎杖-桂枝低、中、高剂量组（3.5，7，14 g·kg-）1。正常对照组和模型组给予等量生理盐水，其他各组给予相应药物灌胃，每天 1 次，连续 7 d。于灌胃的第 4 天.模型组与各给药组大鼠右后踝关节注射 25 mg·mL-1 尿酸钠（MSU）0.2 mL 1 次，正常对照组给予同量的生理盐 水，观察各组大鼠不同时间点足趾容积的变化；第 7 天灌胃 1 h 后取血，ELISA 法测定血清白细胞介素 1β（IL-1β）、转化生长因子-β（TGF-β）含量，荧光定量 PCR 检测外周血单核细胞 Toll 受体 2（TLR2）、Toll 受体 4（TLR4）及髓样分化因子 88（MyD88）的表达。取血后处死动物，取右后踝关节进行病理学观察。结果 与模型 组比较，在造模后 2 h 和 6 h 虎杖-桂枝药低、中剂量组可显著减小大鼠足趾容积率，48 h 和 72 h 虎杖-桂枝 药对低、中、高剂量组大鼠足趾容积均显著减小，差异有统计学意义（P ＜ 0.05）。虎杖-桂枝药对各剂量组可不 同程度的减少关节滑膜炎症细胞浸润反应和血管充血程度。与模型组比较，虎杖-桂枝药对各剂量组可显著减 少 IL-1β 的含量，抑制 TLR2、TLR4 及 MyD88 基因的表达（P ＜ 0.01）。结论 虎杖-桂枝药对低、中、高剂量 组对急性痛风性关节炎大鼠具有显著的改善作用，其机制可能是通过影响血中 IL-1β 的水平，下调 TLR2、 TLR4、MyD88 基因的表达来发挥作用。

关键词：虎杖-桂枝药对；痛风性关节炎；TLRs/MyD88 通路；大鼠急性痛风性关节炎是由血液尿酸增高，尿酸钠（MSU）结晶沉积于关节滑膜及周围组织而引起的急性炎症反应 [1]。临床治疗痛风的药物主要为化学药，长期使用具有较大的副作用，中药长期使用毒副作用小，具有显著优势。既往研]表明，含有虎杖的复方对痛风具有明显疗效；桂枝及其提取物能拮抗多种急、慢性炎症反应，具有显著的抗炎作用。

本课题组  前期研究[3]发现，药对虎杖 - 桂枝对急性痛风性关节 炎具有显著的改善作用，但其作用机制仍未阐明。 MSU 晶体作为一种危险信号被细胞表面和胞质的模 式识别受体，如 Toll 受体 2 （TLR2）、Toll 受体 4 （TLR4）、CD14 等分子所识别，TLR2/TLR4 与病原 相关分子模型（PAMPs）结合后，其本身结构发生二 聚化，活化髓样分化因子 88 （MyD88）， 活化后的 MyD88 经过一系列的作用最终激活核转录因子 kappa B（NF-κB）以及后续白细胞介素 1β（IL-1β）的释放。 国内外研究[表明， 痛风出现的炎症发病机制与 TLRS/MyD88 信号转导通路密切相关。本研究通过建 立急性痛风性关节炎大鼠模型，探讨药对虎杖 - 桂 枝对急性性痛风性关节炎及 TLRS/MyD88 信号的影 响。

1 材料与方法

1.1 动物  SD 大鼠，雄性，SPF 级，体质量（200±20）g，广东省动物中心提供，动物许可证号：SCXK （粤）2008-0002。

表 2  各组对急性痛风性关节炎大鼠不同时间点足趾容积率的比较（x ± s，n=8）

 Table 2  Effect of herb pair Huzhang- Guizhi on the digital volume of rats with acute gouty arthritis induced by sodium urate at different

times

 组织未见异常，滑膜组织光滑完整，软组织内可见正 主要为中性粒细胞﹑淋巴细胞。各给药滑膜及周围软常血管，纤维结缔组织无炎细胞浸润。模型组滑膜及    组织内见少量 - 中等量炎细胞浸润，部分小血管扩周围软组织广泛充血﹑水肿，表面有纤维素粘附，滑 张充血，间质纤维组织增生。参考文献标准[9]对滑膜

 A. 正常对照组 B. 模型组 C. 秋水仙碱组     D. 虎杖 - 桂枝低剂量组 E. 虎杖 - 桂枝中剂量组 F. 虎杖 - 桂枝高剂量组

图 1  大鼠关节滑膜组织病理图（200×）的病理染色结果进行判断，模型组滑膜衬里增生、血    （P＜0.05，P＜0.01）；虎杖 - 桂枝高剂量组在改善滑管充血、纤维素沉积、滑膜组织内炎症细胞浸润情况    膜衬里增生方面效果明显，与模型组比较，差异有统和总积分值均明显增加，与正常对照组比较，差异有 计学意义（P＜0.01）；虎杖 - 桂枝低、中剂量组在改统计学意义（P＜0.01）；虎杖 - 桂枝低、中、高剂量    善纤维素沉积方面效果明显，与模型组比较，差异有组血管充血、滑膜组织内炎症细胞浸润和总积分值均    统计学意义（P＜0.05）。见表 3。

2.3 药对虎杖-桂枝对急性痛风性关节炎大鼠血清IL-1β、TGF-β 含量的影响  与模型组比较，虎杖 - 桂枝低、中、高剂量组大鼠血清 IL-1β 表达量显著降 低，差异有统计学意义（P＜0.01）；虎杖 - 桂枝药对各剂量组 TGF-β 含量有所升高，但差异无统计学意义（P＞0.05）

见表 4。

表 4 各组对大鼠急性痛风性关节炎血清 IL-1β、TGF-β 含量 的影响（x ± s，n=8）

Table 4 The impact of herb pair Huzhang- Guizhi on IL-1β and TGF-β in the serum of acute gouty arthritis rats

 注：与正常对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，▲P < 0.05，▲▲P < 0.01。

2.4 虎杖-桂枝药对对痛风性关节炎外周血 TLR2、 TLR4 及 MyD88 基因表达量的影响 模型组大鼠外 周血 TLR2、TLR4 及 MyD88 基因的表达水平显著升 高，与正常对照组比较， 差异有统计学意义（P＜0.01）。虎杖 - 桂枝药对各剂量组大鼠外周血 TLR2、 TLR4 及 MyD88 的表达水平显著降低， 与模型组比 较，差异有统计学意义（P＜0.01）。虎杖 - 桂枝中 剂量组对 MyD88、TLR4 表达的抑制作用与秋水仙碱组作用相近，差异无统计学意义（P＞0.05），

3.5

 注：与正常对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，▲▲P＜0.01；与秋

 水仙碱组比较，#P < 0.05，##P < 0.01。

 图 2  各组对大鼠急性痛风性关节炎 TLR2、MyD88、TLR4 表达的影响（x ± s，n=8）

Figure 2 The impact of herb pair Huzhang - Guizhi on the expression of TLR2、MyD88、TLR4 of acute gouty arthritis rats

 3 讨论

中药药对是根据药性配对，药物间相互作用以达 到更好疗效的配伍形式，是方剂的重要组成部分。研究中药药对的作用，有利于掌握用药规律，阐明中药 复方的作用机制。虎杖微寒，可清热利湿﹑解毒，散 瘀止痛；桂枝辛温通络，且反佐制约苦寒伤阳凝瘀之 弊。因此，我们复制大鼠急性痛风性关节炎模型，研 究药对虎杖 - 桂枝对大鼠踝关节肿胀度以及对细胞 因子IL-1β、TGF-β 及 TLR2、TLR4/MyD88 信号的影 响，结果发现，虎杖 - 桂枝药对可抑制痛风性关节炎大鼠关节肿胀度，降低 IL-1β 含量、下调 TLR2 TLR4、MyD88 的基因表达，减轻炎症反应。 本实验研究采用经典的 MSU 注射大鼠踝关节造模方法，该方法会出现大鼠关节红肿、发热疼痛，行 走不便，具有急性痛风的特征。给予不同剂量的虎杖 - 桂枝药对后，大鼠关节的肿胀度明显缓解。病理学 研究也发现，不同剂量的中药药对虎杖 - 桂枝可减 少关节滑膜炎症、细胞浸润和血管充血。痛风是 MSU 结晶引起的炎症反应，细胞的炎症级联反应通 常是与单核巨噬细胞的刺激和活化而产生的炎症介质 有关，其中，包括 IL-1β，肿瘤坏死因子（TNF-α）， IL-6 等，研究已经证实 IL-1β 是单核细胞的细胞系 产生的最重要的促炎细胞因子，并且 IL-1β 的产生 是急性痛风性炎症发病的必要物质[10-11]。转换生长因 子 β 受体（TGF-β）对细胞的生长、分化和免疫功能 都有重要的调节作用， 其中， TGF-β1 又可抑制 IL-1、IL-6 的合成与致炎活性。急性痛风炎症发病 期间，IL-1β 的含量显著性增加，后期 TGF-β1 的含 量上调诱导痛风的自发缓解，通过多个方面抑制炎症反应也得到了验证。本实验结果表明，不同剂量的 虎杖 - 桂枝药对均可不同程度的降低 IL-1β 的含量， 减轻机体炎症反应的作用。

Toll 受体（TLRs）是先天免疫的识别受体，能够识 别 PAMPs 和损伤相关分子模型（DAMPs），主要表达 于免疫细胞， 包括单核细胞、巨噬细胞和粒细胞 等[13-14]。TLRs 属于Ⅰ型跨膜蛋白受体，多数 TLRs 有 细胞质 Toll/IL-1 受体（IL-1R）域，它是激活下游信号 途径所需的部位，从而导致 NF-κB 的活化[6]，并诱导 炎症因子如 IL-1 和粘附分子等基因的表达，国外研 究[14-15]表明，IL-1β 的产生确实与 TLR4 的激活有关。 髓样分化因子 88（MyD88）是一种转接蛋白，TLRs 通 过 MyD88 依赖性途径或 MyD88 非依赖性途径进行信 号传递，识别入侵病原体，激活天然免疫，其中， TLR2 是由 MyD88 依赖性途径介导的；TLR4 可同时 经过 MyD88 和 TRIF 两条途径进行信号传导，MyD88 在 MSU 产生免疫反应中是必不可少的转接蛋白[11-15]，

此通路在炎症发病中具有重要作用。本实验结果显 示：模型组 TLR2、TLR4、MyD88、IL-1β 表达量均 显著性增高，可激活 TLRS/MyD88 信号通路，促使 IL-1β 的合成释放，增强机体的炎症反应。各给药组 均能不同程度下调 TLR2、TLR4、MyD88 的表达量而 减少 IL-1β 的表达量，抑制机体的炎症反应。

药对虎杖 - 桂枝对痛风性关节炎大鼠模型急性炎症有明显的抑制作用，可缓解关节肿胀，减少关 节滑膜炎症细胞浸润反应和血管充血。其作用可能 是通过抑制 IL-1β 的分泌， 抑制炎症过程中的 TLR2、TLR4/MyD88 信号通路，减少炎症因子的生 成。TLRs/MyD88 信号通路是治疗痛风一个非常有前 景的靶点，为后续探讨中药治疗痛风作用奠定了基 础。