本期AVT小编分享一下PEG功能化磷脂与脂质体稳定性的那些事儿，聚乙二醇(PEG)衍生化磷脂的种类、分子量、用量等对脂质体的稳定性都会产生影响,可以改善脂质体稳定性,在延长脂质体体内循环时间及在新型脂质体中也发挥了不小的应用。感兴趣的小伙伴一起来了解下吧！

脂质体具有靶向、长效、可降低药物毒性及增加药物稳定性等多方面的优点.但也存在一定的不足和问题,如脂质成分易氧化水解、脂质体易聚集以及脂质体进入血循环后易被网状内皮系统(RES)细胞快速清除、靶向脂质体在体内发挥作用前难以保证其完整性等。为克服以上不足,立体稳定脂质体应运而生。立体稳定脂质体是一种表面含有天然或合成聚合物修饰的类脂衍生物的新型脂质体。修饰聚合物的种类有聚乙二醇(PEG)、聚丙烯酰胺(PPA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等,其中PEG是最常用的一种。PEG分子与磷脂分子通过共价键结合形成PEG衍生化磷脂,能有效地保护脂质体,使脂质体物理、化学及生物稳定性大大提高。

实验证明,PEG衍生化磷脂能降低脂质体的渗漏率,减少其聚集和融合,延长有效期。在体循环中则可抑制细胞粘附,屏蔽RES对脂质体的识别和摄取,延长脂质体体内循环时间,因此,此类脂质体又称长循环脂质体。如用二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、胆固醇(CH)、胆固碎-3-硫酸酯、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)-PEG2000通过冻融法制得的链澈酶脂质体,tz和AUCo-比直接使用药物时分别增大16.3倍和6.1倍"。在炎症小鼠模型中,吲嵘美辛的长循不脂质体[磷脂酰胆碱(PC):CH:

PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)=1 :o.5 ∶0.16]比传统脂质体(PC : CH∶PE=1 ∶o.5 ∶0.16)的清除减慢.AUCo ,显著增大.表明PEG-磷脂衍生物能明显延长脂质体的体循环时间[21。

1 PEG衍生化磷脂提高脂质体稳定性的机制
1.1粒子间斥力
PEG-磷脂在脂质体的脂质双分子层表面形成聚合物保护层,使粒子间斥力增加,从而使脂质体稳定性增加。理论上,距离粒子表面s处既存在着范德华引力,又存在着粒子间斥力,当斥力大于或等于引力时,粒子稳定:反之,则脂质体聚集。如当s约为粒子直径的1/10时,即聚合物衣层厚度约为粒子直径的1O%时,粒子之间的斥力就足以克服与其它大分子或粒子的相互作用13。
随PEG分子量的增加,粒子间斥力增加,脂质体也越稳定。Needham等4用X射线衍射研究了含4%摩尔分数PEG(1900)-磷脂的脂质体(磷脂:CH为2;1)双分子层结构和粒子间斥力,结果表明,在该浓度,结合的聚合物从脂质体表面伸出大约50A(5nm),增加了膜与膜之间的斥力。这有效地减少了脂质体聚集、融合现象的发生,并抑制脂质体与蛋白、细胞的粘附,增强了其体内外稳定性。

1.2构象云结构
具有柔韧性和亲水性的PEG聚合物在脂质体表面形成的致密“构象云”(conformational clouds),可产生较大的空间位阻效应(steric barrier),抑制其它高分子物质与脂质体表面接触,包括血浆成分的吸附,防止脂质体被RES识别和摄取,甚至在较低浓度下就能产生很强的保护作用。这种保护作用可能同疏水链与脂质体膜核心或表面相互作用的能量的平衡和PEG链在溶液中自由运动的能量有关例。Belsito等6用电子自旋共振(ESR)和光密度测量法研究了水分散体中PEG-PE与卵磷脂的相互作用,证实了构象云结构的存在。

1.3 水化膜结构
PEG的亲水性可使脂质体表面形成水化膜,掩盖脂质体表面的疏水性结合位点,降低RES对脂质体的识别和摄取,延长体循环时间7.8。如PEG-PE的硫水性长链有利于将分子插入脂膜.而亲水性部分则伸展于脂膜表面,在脂质体表面形成较厚的水化膜保护层,从而提高脂膜亲水性并造成空间位阻,增强稳定性,这种作用随PEG分子量增加而增加。水化膜保护层的形成增加了脂质体的亲水性,使脂质体在极性溶剂中更稳定,有利于脂质体的保存9。

2影响PEG衍生化磷脂脂质体稳定性的因素
2.1 PEG 分子量
随PEG分子量的增加(由2000增至5000)，其延缓脂质体中钙黄绿素(calcein)渗漏的作用明显增强,屏蔽RES对脂质体的识别和摄取作用也增强9。Bedu-Addo等1011证明增大PEG-磷脂中PEG的分子量及其结合率能有效抑制脂质体的聚集。PEG-PE 与PC的混合物的物理状态取决于PEG-PE中PEG的分子量, 3种物理状态分别为:各组分星可混溶的薄层相、分离的薄层相及
混合胶团。在研究分子量分别为1000~3000. 5000、12000的短、中长、长链PEG对脂质体稳定性的影响时发现,7%摩尔分数以上的PEG( 1000-~3000)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)和11%摩尔分数的PEG(5000)-DPPE在二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)中有强烈的形成混合胶团的趋势。所有浓度的PEG(12000)-DPPE和大于8%摩尔分数的PEG(5000)-DPPE则均形成分离的薄层相。表明低浓度的短链PEG可形成混溶的脂质双层,最适宜用作对药物载体的修饰,而在浓度较高时易使脂质双层溶解而导致药物泄露。高分子量的PEG可使脂质体更稳定,但分子量大于5000的PEG在某些处方中不适用,原因可能在于产生了相分离。

2.2 PEG含量
脂质体的稳定性随PEG含量的增加而增加。Belsito等0发现脂质体聚合物的稳定性对亲水性端基的大小和PEG-PE的含量有很强的依赖性,用自旋标记的ESR对PC/PEG-PE混合物的定量研究发现,脂质双分子层结构随PEG-PE含量的改变而改变。随PEG-磷脂浓度的增加,其抑制脂质体凝聚程度也增大121。Chin 等

3发现结合15%摩尔分数DSPE-PEG(2000)的磷脂酰丝氨酸(PS)脂质体的循环时间与含有5%摩尔分数DSPE-PEG(2000)的中性脂质体循环时间明显不同。前者可有效地降低PS脂质体的亲和力,减少PS介导的血浆蛋白粘附,大于80%的凝血素粘附和促凝血活性被抑制:当含量下降时该保护作用降低。随PEG-磷脂浓度的增加,粒子间斥力及脂质体的体内、外稳定性也增大。

2.3 PEG-磷脂的类型
不同PEG聚合物的性质及体内外表现均不同。在37C、pH7.4 缓冲溶液中,PEG(5000)-DPPE和PEG(5000)-DSPE的临界胶团浓度分别为70和9mmo/L.当这些PEG-磷脂的胶团分散体与含有16或18个碳原子的磷脂膜囊泡混合后, PEG-磷脂胶团分离成单体,然后自发结合到已形成的囊泡的表面。在结合过程中, PEG-DPPE的结合率比PEG-DSPE快,这是因为前者分离成单体的速率较快。而PEG-DSPE的强疏水作用使其结合率常数比PEG-DPPE大。PEG-DSPE 和C。膜的组合为最佳的热力学稳定配对1141。Parr等1151研究表明DSPC、CH及单甲氧基聚乙二醇2000-琥珀酰-棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺[MePEG(2000)-S-POPE] (50:45:5,摩尔比)组成的大单室脂质体(LUVs)只能稍延长循环时间。而由DSPC、CH和MePEG(2000)-S-DSPE组成的LUVs在体内却极少发生PEG衍生化磷脂层的化学破坏,循环时间显著延长。可见DSPE较POPE与PEG (2000)结合的效果更优。

2.4 PEG-磷脂脂质体的粒径
研究表明,用不同的PEG-磷脂可制备不同粒径的脂质微粒(多室、小单室、大单室脂质体),稳定性较好:半年后PEG-磷脂脂质体在缓冲溶液中释出的亲水性标记物小于5%,在血浆中tin长达几天16。Litzinger等171制备了>300nm、150~200nm 和<70nm的3种粒径分布的PEG-磷脂质脂体,并考察了在小鼠体内的分布,结果表明,大粒径和小粒径的PEG-磷脂脂质体分别在脾和肝中的浓度较高,中间粒径的具有长循环特性。小粒径脂质体长循环减弱的原因直接与PEG-PE的活性有关,而大粒径脂质体则可能是通过过滤机制被脾摄取。脂质体在血中的稳定性、清除率及生物分布情况都取决于其组成、粒径及荷电情况，其中100~200nm粒径范围内的脂质体由于空间位阻的原因在血液中较稳定[81。Unezaki等[91研究的温度敏感型PEG-磷脂脂质体,其最佳平均粒径也在180~200nm范围内.

3 PEG衍生化磷脂在新型脂质体中的应用
3.1pH敏感脂质体
结合PEG-磷脂的脂质体可制成低pH敏感的立体稳定脂质体。Guo等1201制备了对较低pH敏感的PEG结合物(POD)，在中性环境下能稳定3h以上,但在pH5下lh内就可能完全降解。含有10%POD和90%二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)的脂质体在中性缓冲液中能稳定存在12h以上:然而当该脂质体处于温和酸性条件(pH5.5)下时,脂质体很快聚集并在30min内释出大部分内容物。因此可通过pH控制药物靶向至弱酸性的生理环境
(如核内体、固体瘤和炎性组织)释放。

3.2阳离子脂质体
当药物的电性与脂质体膜电性相反时.药物包封率高且稳定。结合不同类型的PEG聚合物可制得中性、负电性、正电性脂质体。如--种新型的结合阳离子PEG-磷脂(CPL)的脂质体2,能插入已形成的囊泡中并增强脂质体的稳定性。对以4种端基上含有不同正电荷的CPL(分别为CPL~CPL)制得的阳离子LUVs的胶束溶液的研究发现,CPL插入LUVs外部小叶上的方式在某种程度上取决于温度、时间、CPL/ 磷脂的比例和LUVs的结构,同时也与LUVs中的CPL种类有关。CPLs可使脂质体与细胞的粘附增加3倍,而CPL可增加10倍。同时,磷脂摄取的增加与总的表面电荷无关,而与CPL末梢端基上增加的正电荷的密度有关.

3.3免疫脂质体
传统的免疫脂质体具有良好的靶向性,但在体内易被清除。采用PEG-磷脂连接特异性抗体则可以达到长循环的效果,但结合方式不同,脂质体的靶向性也不同。Maruyama等121研究了传统免疫脂质体(A)、含PEG的免疫脂质体(B)和含6%摩尔分数DSPE-PEG-COOH的PC-CH(2: 1)新型免疫脂质体(C)的靶向性。小鼠肺特异性免疫试验结果表明,由于PEG可减少RES的摄取而使B具有长循环特征,但B的抗原.抗体结合仅为A的一半,这可能与PEG链的空间位阻阻碍了抗原-抗体的特异性结合有关。而C不仅具有长循环特征,其抗原.抗体结合率约为A的1.3倍,表明免疫性抗体与PEG链的末端结合可以减少PEG链空间位阻对抗原.抗体结合的屏蔽作用。

4结语
PEG行生化磷脂对提高脂质体稳定性有众多优点，但新的PEG衍生化磷脂的结构鉴定、毒性研究等费时费力,限制了它的广泛应用。已有研究表明PPA、PVP、ATTAn低聚体、聚-2-甲基聪唑啉(PMOZ)、聚.2-乙基唔唑啉(PEOZ)等与磷脂结合后显示与PEG衍生化磷脂相似的体内行为,可为寻找替代品提供新的方向23~-25。PEG衍生化磷脂脂质体的良好稳定性使其可用于其它药物传递系统,如利用PEG-磷脂脂质体包裹造影剂,用于肾脏等器官的影像诊断:或制成喷雾剂,用于肺结核等肺部疾病的治疗,以减少口服抗结核药物的肝损害等。艾伟拓（上海）医药科技有限公司2007年至今，专注与脂质体，脂肪乳为代表的注射剂领域，为您分享脂质体与脂肪乳相关行业资讯。
参考文献:
1、 Kim IS,Choi HG,Choi HS,et al. Prolonged systemic deliveryof sureptokinase using liposome[]. Arch Pharm Res,1998,21(3): 248-252.
2、 Woodle MC .Storm G.Newman MS.et al Prolonged systemicdelivery of peptide drugs by long-circulating liposomes: ilus-tration with vasopressin in the Brattleboro rat[]. Pharm Res,
3、Lasic DD. Novel application of liposomes[J]. TrendsBiotechnol, 1998,16(7):307-321.
4、Needham D,Mclntosh TJ,L asic DD. Repulsive interactions and mechanical sability of polymer-grafted lipid membranes[J].Biochim Biophys Acta,1992,1108<1);: 40-48.
5、Torchili VP. Polymer coated long circulating microparticulate pharmaceuticals []. J Microencapsul, 1998,15(1): 1-19.
6、Belsito S.Bartucci R.Montesano G,et al. Molecular and mesoscopic properties of hydrophilie polymer-grafted phos-pholipids mixed with phosphatidylcholine in aqueousdispersion: interaction of dipalmitoyl N-poly (ethylene glycol) phosphatidylethanolamine with dipalmitoyIphos-phatidylcholine studied by spectrophotomery and spin-label electron spin resonance(J]. Biophys J.2000,78(3)1420- 1430.
7、Woodle MC,Lasic DD. Sterically stabilized liposomes[J].Biochim Biophys Acta, 199.,113(2): 171-199.
8、Blume G, Cevc G. Molecular mechanism of the lipid vesicle longevity in vivo[J]. Biochim Biophys Acta, 1993,1146(2): 157-168.
9、侯 新朴,张俊梅,鲁先道. PEG修饰脂膜对延长脂质体在血内循环时间的研究[J].药学学报, 1996.31(6):451-454.
10、Bedu-Addo FK,Tang P,Xu Y,et al Interaction of polyethylene glycol- phospholipid conjugates with cholesterol-phosphatidyl-choline mixturesterically stabilized liposome formulations[J].Pharmn Res, 1996,13(5): 718-724.
11、 Bedu-Addo FK.Tang P.Xu Yet al Efcts of polyethylene 8ly-col chain length and phospholipid acy chain composition on the interaction of polyethylene glycol-phospholipid conjugates with phospolipid: implications in liposomal drug delivery[J].Pharn Res, 1996.13(5): 710-717.
12、Mori A.Klibanov AL,Torchilin VPet al Influence of the steric barrier activity of amphipathic poly(ethyleneglycol) and gan-glioside GMI on the circulation time of liposomes and on the target binding of immunoliposomes in vivo[J] FEBS Lett, 1991,
13、Chiu GN,Bally MB,Mayer LD. Selective protein interactins with phosphatidylserine containing liposomes alter the steric stabilization properties of poly (ethylene glycol)[J]. Biochim Biophys Acta,2001,1510(1-2): 56-59.
14、Sou K.Endo Takcoka S,et al. Poly (ethylene glycol)-modifi-cation of the phospholipid vesicles by using the spontancous incorporation of poly (ethylene glyo)-lipid into the vesicles D Bioconjug Chem, 20011(3);) 372-379.
15、Par MJ,Ansell SM.Choi LS,et al Factors influencing the re-tention and chemical stability of poly(ethylene glycol)-lipid conjugates incorporated into large unilamellar vesicle[J].
16、Zeisig R,Eue L,Kosch M,et al. Preparation and properties of sterically stabilized hexadecylphosphocholine (miltefosine)-liposomes and influence of this modification on macrophage activation. Phase behavior and aggregate structure in mixtures of dioleoylphosphatidylethanolamine and poly (ethylene glycoD)-lipids[J]. Biochim Biophys Acta,1996.1283(2): 177-184.
17、Litzinger DC.Buiting AM,van Rooijen N,et al. Effect of lipo-some size on the circulation time and intraorgan distribution of amphipathic poly(ethylene glycol)-containing liposomnes[J].Biochim Biophys Acta, 1994,1190(1): 99-107.
18、Oku NNamba Y. Long .circulating liposomes([]. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1994,11(4): 231-270.
19、Unezaki s,Manuyama K,Takahashi N.et al. Enhanced delivery and antitumor activity of doxorubicin using long-circulating thermosensitive liposomes containing amphipathic polyethyl-ene glycol in combination with local hyperthermia[J]. PharmRes, 1994,11(8): 1180-1185.
20、Guo X.Szoka FC Jt. Steric stabilization of fusogenic liposomes by a low-pH sensitive PEG-diortho ester-lipid conjugate[J].Bioconjug Chem. 2001.12(2): 291-300.
21、Fenske DB.Palmer LR.Chen T,et al Cationic poly(ethylene glycoD) lipids incorporated into pre pormed vesicles enhance binding and uptake to BHK cellJ]l. Biochim Biophys Acta,2001,1512(2): 259-272.
22、Maruyama K,Takizawa T,Yuda Tet al. Targetability of novel immunoliposomes modified with amphipathic poly(ethylene glycol)s conjugated at their distal terminals to monoclonal antibodies[]. Biochim Biophys Acta. 1995,1234(1); 74-80.
23、Ansell SM,Kojic LD.Hankins JS.et al. Applic ation of oligo-(14-amino-3.6.9.12- tetraoxateradecanoic acid) lipid conju-gates as steric barrier molecules in liposomal formulations[J].Biocorjug Chem.1999. 10(4): 653-666.
24、Torchilin VP.Shtilman MI,Trubetskoy VS.et al. Amphiphilic vinyl polymers effectively prolong liposome circulation time in vivo[J]. Biochim Biophys Acta, 1994,1195(1): 181-184.Woodle MC.Engbers CM,Zalipsky s. New amphipatic poly-
25、mer-lipid conjugates forming long. circulating reticuloendot-helial system evading liposomes([J]. Bioconjug Chem.1994,5(6): 493-496.
本文内容分享自《聚乙二醇衍生化磷脂与脂质体立体稳定性》作者：丁劲松,杨敏,陈―琼