辅酶ⅠNAD(H)含量试剂盒说明书
2021-04-20 来源:本站 点击次数:678测定意义
辅酶ⅠNAD(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，NAD+是糖酵解（EMP）和三羧酸循环（TCA）的主要氢受体，生成的NADH经呼吸电子链（ETC）传递把电子交给氧，在合成ATP的同时，形成大量的ROS，同时NADH再生为NAD+。糖、脂、蛋白质三大代谢物质分解中的氧化反应绝大部分通过这一体系完成。NAD(H)含量和NADH/NAD+比值的高低可用于评价糖酵解和TCA循环的强弱。较高的NAD(H)及NADH/NAD+比值说明细胞呼吸耗氧量较高，处于过氧化状态。此外，NADH/NAD+比值升高也可抑制糖酵解和TCA循环。另外，NAD+降解产物对细胞信号传导、代谢和基因表达等具有重要的调控作用。
测定原理
分别用酸性和碱性提取液提取样品中 NAD+和 NADH，NADH 通过 PMS 的递氢作用，还原
氧化型噻唑蓝（MTT）为甲瓒，在 570nm 下检测吸光值；而 NAD+可被乙醇脱氢酶还原为NADH，进一步采用 MTT 还原法检测。
需自备的仪器和用品
酶标仪、台式离心机、移液器、96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制
酸性提取液：液体 50mL×1 瓶，4℃保存； 碱性提取液：液体 50mL×1 瓶，4℃保存； 试剂一：液体 10 mL×1 瓶，4℃保存；
试剂二：液体 3 mL×1 瓶，4℃保存；
试剂三：粉剂×1 瓶，-20 ℃保存，用时加入 3mL 蒸馏水，混匀，用不完的试剂 4℃保存一周； 试剂四：粉剂×1 瓶，4 ℃保存，用时加入 3mL 蒸馏水，混匀，用不完的试剂 4℃保存一周； 试剂五：液体 3.6mL×1 瓶，4 ℃保存；
试剂六：液体 30mL×1 瓶，4 ℃保存； 试剂七：液体 50mL×1 瓶，4 ℃保存。NAD+和 NADH 的提取
1 血清（浆）中 NAD+和 NADH 的提取
NAD+的提取：按照血清（浆）体积（mL）：酸性提取液体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议取约 0.1mL 血清（浆），加入 1mL 酸性提取液），95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
NADH 的提取：按照血清（浆）体积（mL）：碱性提取液体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议取约 0.1mL 血清（浆），加入 1mL 碱性提取液），95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2 组织中 NAD+和 NADH 的提取：
NAD+的提取：按照组织质量（g）：酸性提取液体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议取约 0.1g组织，加入 1mL 酸性提取液），冰浴研磨，95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 碱性提取液使之中和， 混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
3 细胞或细菌中 NAD+和 NADH 的提取：
NAD+的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量（104 个）：酸性提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 酸性提取液）， 超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次），95℃水浴 5min
（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。NADH 的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量（104 个）：碱性提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 碱性提取液）， 超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次），95℃水浴 5min
（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。测定步骤：
1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 570nm，蒸馏水调零。
2、 加样表(在 1.5mL 棕色EP 管中按下表依次加样）：
| 试剂名称(μL) | 对照管 | 测定管 |
| 样本 | 20 | 20 |
| 试剂一 | 80 | 80 |
| 试剂二 | 30 | 30 |
| 试剂三 | 30 | 30 |
| 试剂四 | 30 | 30 |
| 试剂五 | 30 | 30 |
| 试剂六 | 200 | 混匀，室温避光静置 20min |
| 试剂六 | 200 |
| 试剂七 | 400 | 400 |
注意事项
1、如果一次性测定样本数较多，可将试剂一、二、三和四按比例配成混合液。
2、对照管和测定管的测定步骤的区别：对照管加完试剂一、二、三、四和五后必须马上加试剂六；测定管加完试剂一、二、三、四和五后必须反应 20min 后再加试剂六。
3、反应过程中注意避光。
4、若 NAD+测定中△A（A2-A1）≤0.0302，NADH 测定中△A（A2-A1）≤0.0222，说明样本中辅酶含量较低，已低于检测限，可做如下调整：（1）将测定管避光静置时间 20min延长到 60min；（2）在提取阶段增加取样量，即取 0.2g 样本或 0.2mL 样本加入 1mL 提取液。 5、由于每一个测定管需要设一个对照管，本试剂盒 100 管保证测 48 个 NAD+或 NADH.
NAD+和 NADH 含量的计算
（一） NAD+含量的计算
标准条件下的回归曲线为y = 0.1475x + 0.0302，R2 = 0.9978；其中 y 为△A，x 为 NAD+浓度nmol/mL
1、血清（浆）中NAD+含量计算
NAD+含量(nmol/mL）=[(△A -0.0302）÷0.1475×V1) ]÷(V3×V1÷V2)=135.6×( △A -0.0302）
2、组织、细菌或细胞中 NAD+含量计算(1)按样本蛋白浓度计算
NAD+ (nmol/mg prot）=[(△A -0.0302）÷0.1475×V1)]÷(V1×Cpr)= 6.8×( △A -0.0302）÷Cpr
(2) 按样本鲜重计算
NAD+ (nmol/g 鲜重）= [(△A -0.0302）÷0.1475×V1)]÷(W×V1÷V2)= 13.6×( △A -0.0302）÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算
NAD+ (nmol/104 cell）=[(△A -0.0302）÷0.1475×V1)]÷(500×V1÷V2)=0.027×(△A -0.0302）
（二）NADH 含量的计算
标准条件下的回归曲线为y = 0.1404x + 0.0222，R2 = 0.9976；其中 y 为△A，x 为 NADH 浓度 nmol/mL
1、血清（浆）中NADH 含量计算
NADH 含量(nmol/mL）= [ (△A -0.0222）÷0.1404×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 142.5×(△A -0.0222）
2、组织、细菌或细胞中 NADH 含量计算
(1) 按样本蛋白浓度计算
NADH (nmol/mg prot）= [ (△A -0.0222）÷0.1404×V1) ]÷(V1×Cpr)= 7.1×( △A -0.0222）÷Cpr
(2) 按样本鲜重计算
NADH (nmol/g 鲜重）=[(△A -0.0222）÷0.1404×V1) ]÷(W×V1÷V2)= 14.2×( △A -0.0222）÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算
NADH (nmol/104 cell）= [ (△A -0.0222）÷0.1404×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.028×(△A -0.0222）
V1：加入反应体系中样本体积，0.02mL；V2：加入提取液体积，2mL；V3：加入血清（浆） 体积：0.1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL； W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数， 500 万。
注意：最低检测限为 0.1nmol/mL 或 0.1nmol/g 鲜重 或 0.001nmol/mg prot