要注意的是在一步法（待测抗原与酶标抗体一起加入反应）测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成“夹心复合物"出现钩状效应，甚至可不显色而出现假阴性结果。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）时，应注意可测范围的zui高值。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。 双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（RF）的干扰。RF是一种自身抗体，多为IgM型，能和多种动物IgG的Fc段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF，它可充当抗原成份，同时与固相抗体和酶标抗体结合，表现出假阳性反应。双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。

双抗体夹心法的简要操作步骤为：

1） 先加入抗体，使抗体固定结合于载体表面；

2） 再加样品，使目标检测抗原形成抗原-抗体复合物；

3） 加酶标抗抗体（第二种动物抗抗原的酶标抗体）；

4） 加入酶促反应底物，发生显色反应，显色的深浅与待测抗原的量成正比。