近年来，三维 (3D) 培养模型作为一种有效的生物研究工具越来越受到认可。与传统的单层培养系统相比，3D 培养的细胞更接近于模拟生物体的生理环境。一种广泛使用的 3D 培养技术是多细胞球体的应用。球状体是无异物生长的微型球形细胞团。
 

2. 方案介绍

有多种方法可用于生成球体。所有可用的方法都可以防止细胞附着在培养皿基质上，从而增加与邻近细胞和细胞外基质的相互作用。在本应用说明中，我们使用液体叠加技术来生成球体。这种方法是形成球体的最简单的方法之一，并有几个优点。首先，可以生成和监测单个球体，从而可以轻松评估生长动力学和球体特性。其次，简单的培养基交换允许更长的培养时间。最后，不需要特殊设备。简而言之，在加入细胞悬液之前，孔用琼脂糖包被。除了提供非粘性表面，琼脂糖包被的孔还增加了细胞与细胞之间的接触，因为细胞聚集在它们的凹底上。
 

本方案用以下实验材料：

· µ-Plate 血管生成 96 孔 ibiTreat (ibidi, 89646)

· 1% 琼脂糖（溶于 PBS）（例如 Sigma-Aldrich Chemie GmbH，A9539）

· 胰蛋白酶或细胞分离的替代品

· 细胞培养基

 以下需要设备：

· 用于融化琼脂糖的热培养箱、微波或高压釜

· 用于测定生长动力学的倒置显微镜

· 细胞培养箱（通常为 37°C、5% CO2 和 95% 相对湿度）
 

材料的制备：

1. 在 PBS 中制备 1% 琼脂糖。

2. 用 30 µl 琼脂糖涂抹孔。琼脂糖形成凝胶并在 10 分钟内冷却至室温。该体积适合完全覆盖孔的表面并产生凹面。

注意：琼脂糖应放置在温水浴中，以防止移液过程中过早凝胶化。此外，吸头和板应在制备前一小时置于 50°C。
 

球体形成：

1. 像往常一样准备细胞悬液。

2. 制定细胞数并将细胞悬浮液稀释到所需的细胞浓度（考虑图 1 作为参考）。

3. 将 55 µl 细胞悬浮液加入到每个孔中。

4. 在细胞培养箱中孵育板。

5. 在两天的初始孵育时间后，应每隔一天轻轻更换培养基。尽量减少板的移动，特别是在球体启动期间。

6. 球体的形成和生长可以使用相差显微镜和球体活力进行评估，使用荧光素二乙酸酯 (FDA)/碘化丙啶 (PI) 染色，使用 FDA 和 PI 进行活/死染色”。
 

· 可以通过调整播种浓度或孵化时间来控制球体的大小和特性（图 1）。

· 球体形成、生长动力学和球体特征取决于细胞类型（图 2、3）。

· 血清的类型和质量严重影响球体的形成和生长。

· 不规则或不充分的琼脂糖涂层会导致形成几个不规则的球体和/或每孔细胞粘附。不要让琼脂糖冷却到 50°C 以下，以尽量减少分配过程中凝胶化的风险。

· 不规则和非圆形球体的形成可归因于培养基和/或血清中的小颗粒。如果需要，通过显微镜监测培养基和培养基补充剂，并通过无菌过滤器过滤补充培养基。
 

图 2. HT-1080 和 HeLa 细胞系的球体形成和生长，在 µ-Plate Angiogenesis 96 孔中以不同的初始细胞浓度接种。 （比例尺：800 µm）

图3.MCF-7 球体的球体生长取决于播种浓度和培养时间

图4.MCF-7 球体大小与坏死中心大小之间的相关性

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