本应用实验是在µ-Slide球体灌注载玻片中创建多细胞球体示例。从鼠成纤维细胞系L929的悬浮液形成球状体后，用ibidi Pump System灌注。这样可以确保长期培养过程中球体的最佳营养。
 

· μ-Slide球体灌注生物惰性载玻片（80350，ibidi，德国）

· 鼠成纤维细胞L929系（ACC 2，DSMZ，德国）

· 细胞培养基（RPMI-1640（21875034）与FCS（10270106），Gibco）

· 切割酶（A1110501，Gibco）

· ibidi泵系统（10902，ibidi，德国）

· 蓝色灌注套件，15厘米，内径0.8毫米（10961，ibidi，德国）

· 标准细胞培养设备（无菌工作台，细胞培养培养箱，培养瓶，PBS等）

重要说明：在37°C和5％CO2的培养箱内过夜，平衡所有必需的材料，如µ-Slides，培养基和管道（灌注套件）。这对于防止气泡随时间流逝至关重要。

· 在培养基中培养L929细胞。

· 用Accutase处理细胞1-2分钟以使其脱离。

· 收获细胞悬液。

· 离心细胞悬液并在培养基中稀释；该量取决于所需的细胞浓度。

· 计数细胞并调整至5 x 105细胞/ ml的浓度。

· 根据说明准备µ-Slide。

· 将细胞接种到µ-Slide的通道中。不要忘记为静态控制接种细胞。

· 在37°C和5％CO2下孵育过夜以形成球状体。

· 在相衬显微镜下观察球状体的形成。

· 可选：形成球状体后，用新鲜培养基洗涤1次。

在开始灌注之前，在37°C和5％CO2中孵育一小时

· 根据说明准备用于流动连接的µ-Slide，ibidi泵系统和灌注套件。

· 要清除系统中的气泡，请在连接µ-Slide之前使其运行1-2小时。

· 将µ-Slide连接到管路和泵系统。

· 以5 mbar开始灌注实验，流速为0.75 ml / min。

· 确定流速。如有必要，请调节压力以创建所需的流速。

· 对于静态培养，请按照µ-Slide球体灌注的说明每两天进行一次培养基更换。

接种后立即开始形成球体。在长期培养过程中，施加流量会导致球体更强的增殖，由于最佳营养，导致球体直径增加。

L929成纤维细胞在µ-Slide球状体灌流中显示球状体形成，Bioinert，第1-14天，接种浓度为5 x 105单细胞/ ml。上部图：用ibidi Pump System灌注，0.75毫升/分钟。下部图：无灌注，第二天换培养基。相衬显微镜，10倍物镜，孔直径800 µm。
 

在μ-Slide球状体灌流，生物惰性，接种浓度5 x 105单细胞/ ml中比较L929成纤维细胞的球状体形成。静态：无灌注，第二天换培养基。灌注：使用ibidi Pump System灌注，0.75毫升/分钟。

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