Evosep One助力基于去泛素化酶抑制剂的高通量活性蛋白分析
2022-01-29 来源:本站 点击次数:2319
基于活性探针（ABPs）可以评估细胞环境中的酶活性和抑制作用，与传统的生化酶分析相比具有较大的优势。由于蛋白质组学应用中样品制备的复杂性，基于蛋白活性分析（ABPP）的限制之一是相对较低的通量。在本文研究中，作者开发了一种基于活性的蛋白质分析与酶抑制剂结合起来，以高通量的方式，允许同时快速筛选多种抑制剂的浓度。该工作流程在保持其酶谱特征的同时，将传统ABPP工作流的通量提高了约十倍。
Evosep One高通量蛋白组学分离系统，其采用即用即抛的Evotip作为常规耗材，能大幅度简化蛋白组学前处理流程和降低样本残留污染，节省空白样本检测时间，同时设备具备创新型高低压管路系统设计，从而能极大提高样本通量和系统稳定性，从而对此类大规模样本的通量上能有显著提升。
研究方法：
Evosep One与Bruker timsTOF Pro质谱连用对MCF-7、SH-SY5Y细胞系和小鼠脑组织进行检测，采用100样/天的方法、1.5μL/min的流速，与Thermo U3000液相+ Thermo Q Extractive质谱、 250 nL/min的流速检测结果对比。
研究结果：
1.高通量活性的蛋白质分析（ABBP-HT）前处理工作流程优化：
Figure 1 Accelerated DUB inhibitor ABP IP workflow.
优化流程如下所示：
（A）完整或溶解组织/细胞系的蛋白质提取和抑制剂处理。
（B）HA-Ub-PA探针孵育以标记未抑制的半胱氨酸活性DUB。
（C）抗HA IP，传统上采用离心或低通量琼脂糖珠磁收集的方式。在这项工作中，使用安捷伦bravo液体处理平台96孔板形式提高通量。
（D）免疫沉淀DUB的LC-MS/MS蛋白质组学分析。比较了使用QE Orbitrap和高通量timsTOF获得的DUB深度。
2.前处理优化结果：
Figure 2. Optimizing the ABPP-HT workflow.
图2A显示，250µg上样量提供了最大的DUB ID。图2C显示QE-Orbitrap/ timsTOF MS、0.15%TFA、6 M尿素、HEPES*柱上消化，通过不同洗脱方法确定DUB的强度，得出最有效的洗脱是0.15% TFA与溶解液胰蛋白酶消化相结合。图2D、图2E将Evosep One + timsTOF Pro的纳升流速与U3000+ Q Extractive进行比较，在相应梯度长度上确定的DUB数量（分别为23和22）没有显著差异。与QE MS相比，使用Evosep + timsTOF通过TFA洗脱鉴定的DUB数量减少20%，但质谱利用率大大提高（单次运行, 15 min VS 160 min）。
Figure 3. Optimizing the ABPP-HT workflow.
由图3结果可知，随着培养时间的延长，尤其是3-b抑制剂，从DUB中转移出来，抑制剂的效力较低。因此，对于可逆抑制剂，建议尽量减少探针的孵育时间。使用ABPP-HT工作流程比较了两次标记时间，当裂解物与探针一起孵育较短时间（10 min VS 45 min 图2H）时，一些DUB的强度明显降低。因此作者在图2I总结了这些优化步骤:（i）优化探针与蛋白质的浓度比；（ii）优化要加载到柱上的蛋白质量；（iii）检查是否存在感兴趣的DUB；（iv）优化探针孵育时间。
3.去泛素化酶浓度的筛选
Figure 4 ABPP-HT allows fast generation of DUB inhibitor selectivity profiles in a cellular context.
图4（A-D）小鼠脑组织和MCF-7细胞裂解物中FT671特异性抑制剂和NEM（半胱氨酸修饰物）浓度依赖性的USP7、HA和GAPDH免疫印迹。FT671在细胞系（图4A）和脑组织（图4B）中均抑制USP7，HA印迹显示FT671与其他标记DUB的反应性很小。另一方面，NEM也在细胞（图4C）和大脑（图4D）中抑制USP7。
4.ABPP-HT显示DUB抑制剂的选择性和特异性与更高的通量。
Figure 5.ABPP-HT reveals DUB inhibitor selectivity and specificity compatible with higher throughput.
图5(A-C)分别从timsTOF MS中鉴定出的MCF-7、小鼠脑裂解液、MCF-7裂解液的DUB活性分析。（D-I）MCF-7裂解液中USP7抑制剂FT671、FT827、HBX41108和P22077的浓度依赖性，以及小鼠大脑中3-b和39的USP30抑制剂的浓度依赖性。图（J）为D-I提取的IC50值，拟合方程为Y=100/(1 + X/IC50)。分析多种浓度的能力也允许绘制和确定所述条件下每种抑制剂的半最大抑制浓度（IC50）。
结果与讨论：
与常规的ABPP相比，该方法的深度有所降低，使用ABPP-HT时检测到15-25个DUB，而使用传统ABPP时检测到的DUB为30-40个。与探针反应并被ABPP检测到的DUB数量高于70，但这需要在LC-MS/MS分析之前对样品进行高ph的预分馏，这大大增加了每种条件下需要分析的样品数量，需要分析的时间和成本。
Figure 6. ABPP workflows optimized for DUBome depth and throughput.
图6比较DUB鉴定深度的ABPP分析（Y轴）和不同检测方法包括传统ABPP、基于免疫印迹的ABPP和高通量ABPP（ABPP-HTP）的分析。X轴代表不同方法的检测样本数量，绘制的圆圈大小代表了每种受试抑制剂化合物的相对成本。可以看出作者新开发的检测方法（ABPP-HTP）的鉴定深度略低于传统方法，但通量远大于传统方法。新方法大大提高了检测效率。
此外，在两种不同的细胞系和小鼠脑组织中使用DUB抑制剂证明了该方法的多功能性。ABPP-HT允许同时分析六种选择性DUB抑制剂，并计算其各自的半最大抑制浓度（IC50）值。该方法能够同时测试更多的抑制剂和浓度。
作者觉得ABPP-HT的通量可以进一步提高。例如TMT（串联质量标签），将多达16个样本组合成一个样本，从而提供多路复用能力和增强的通量。另一个可通过实施目标蛋白质组学方法进一步提高此类分析灵敏度和DUB覆盖率，如数据独立采集（DIA）质谱法。
参考文献：Jones H B L, Heilig R, Fischer R, et al. ABPP-HT-high-throughput activity-based profiling of deubiquitylating enzyme inhibitors in a cellular context[J]. Frontiers in chemistry, 2021, 9: 44.
原文链接：https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fchem.2021.640105/full?ref=image
Evosep成立于2016年，总部位于丹麦Odense，其产品EvosepOne于2017年的HUPO上正式发布。EvosepOne，中文名为高通量蛋白组学分离系统，致力于帮助打造标准化的蛋白组学流程，其具有通量高、重复性好，样本残留率低，缩短样本准备时间，性能稳健等优点。所搭配的高通量方法如下图所示：
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