µ-Slide 8 孔高壁进行免疫荧光染色

免疫荧光 (IF) 是使用显微镜深入了解细胞结构和过程的有效方法。这种方法可以评估特定蛋白质的表达和位置，使得免疫荧光对于科学家解决许多细胞生物学问题是必不可少的。

下面我们介绍了一体化简单的方法，用于在 µ-Slide 8 孔高壁中培养和免疫荧光染色粘附的人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)

请注意：在开始细胞免疫荧光实验之前，需要检查几个重要参数，例如目标蛋白质的表达水平、最佳细胞密度以及理想的细胞培养容器几何形状和底物/涂层。此外，还应评估最佳抗体稀释度。此外，阳性和阴性对照是验证 IF 染色所必需的。因此，我们强烈建议在实验前进行彻底的文献研究。

1. 材料

1.1. 试剂和缓冲液

细胞培养

• 人脐静脉内皮细胞（HUVEC、C-12203、Promocell）

• 胶原蛋白 IV（354233，康宁）

• 0.05M HCl (X942.1, Carl Roth)

• 细胞培养基：内皮细胞基础培养基（C-22210，Promocell）和内皮细胞生长培养基补充混合物（C-39215，Promocell）

• PBS（14190144，Gibco）

• 精氨酸酶（A1110501，Gibco）

• PBS（14190144，Gibco）

• 福尔马林，10%，即用型（HT5011，Sigma Aldrich）

• 单克隆抗 α-微管蛋白（T5168，Sigma Aldrich）

• 抗小鼠 IgG-Atto 594 (76085 Sigma Aldrich)

• 鬼笔环肽 488 偶联物（ab176753，Abcam）

• 使用DAPI 的ibidi 抗荧光淬灭剂（50011，同上）

• Triton-X-100（A16046，赛默飞世尔科技）

• 穿透缓冲液（PBS 中0.5% Triton-X-100）

• 封闭缓冲液（PBS 中1% BSA + 0.2% Triton X 100）

• 抗体稀释缓冲液（1% BSA + 0.05% Triton X 100 的PBS 溶液）

• 牛血清白蛋白 (BSA) (A1470-10G, Sigma Aldrich)

• ibidi浸油（50101，同上）

1.2. 设备

• µ-Slide 8 孔高壁，ibiTreat（80806，同上）

• µ-载玻片架（80003，同上）

• 标准细胞培养设备（移液器、无菌工作台、细胞培养箱、培养瓶、细胞培养基、血细胞计数器等）

• 带有适当滤光片组的倒置荧光显微镜

2.方法

2.1.细胞培养

使用前请阅读说明µ-Slide 8 孔高壁，ibiTreat.在无菌条件下执行所有步骤。在开始实验之前，在标准细胞培养瓶中制备 HUVEC（例如，T75，在0.05 M HCl 中涂有 6.7 µg/ml 胶原蛋白IV 1 小时），细胞粘附在底部。细胞在实验当天应该是健康的并且最佳次汇合。

在整个过程中快速工作很重要，这样孔里就不会变干。

如果没有另外说明，所有给定的体积都是每孔的，所有的孵育步骤都是在室温下进行的。

•用 Accutase 处理培养的 HUVEC 1-2 分钟以进行分离。

•收集细胞悬液，离心，用少量培养基稀释后进行计数；量取决于所需的细胞浓度。

•计数细胞，在内皮细胞基础培养基和内皮细胞生长培养基补充混合物中，并调整到最终浓度为 2 x 105cells/ml 。

•打开 ibidi µ-Slide 8 Well高壁的包装并将其放在 µ- Slide Rack 或适当的表面上。

•在每个孔中加入 250µl 的 HUVEC 悬浮液。

•盖上随附的盖子。

•将载玻片与支架一起放入培养箱（37°C，5% CO2）中，让细胞附着至少 3 小时或过夜。

•对于延长细胞培养，我们建议每隔一天更换一次培养基。

2.2.固定、通透和封闭

•为您的实验准备足够的穿透缓冲液和封闭缓冲液。

•使用细胞培养吸液装置从孔中吸出细胞培养基。

•用 PBS清洗细胞：将 200 µl PBS 缓慢加入每个孔中并吸出。

•用 200µl 福尔马林 (10%) 固定细胞 10 分钟。

•去除福尔马林并用 200µl PBS 洗涤细胞 3 次。

•将细胞在 200µl 穿透缓冲液中孵育 10 分钟。

•去除穿透缓冲液并用 200μL PBS 清洗细胞。

•用 200µl 封闭缓冲液封闭 30 分钟。

2.3.染色和封片

• 在封闭步骤中，准备足够的抗体稀释缓冲液来稀释一抗和二抗。

• 在抗体稀释缓冲液中稀释一抗（α-微管蛋白：1:200稀释）。

• 将细胞在 150µl 一抗溶液中孵育 2 小时（请注意，许多抗体需要在 4°C 下过夜孵育）。

• 用 200 µl Blocking Buffer 清洗两次。

• 在相同的抗体稀释缓冲液中稀释二抗和鬼笔环肽（anti-mouse-IgGAtto 594：1:200 稀释度；鬼笔环肽 488 偶联物 1:1000 稀释度）。

• 在黑暗中将细胞在 150 µl 的二抗溶液中孵育 2 小时。从此时起，样品应尽可能保存在黑暗中

• 用 200 µl Blocking Buffer 清洗两次

• 清空所有孔。

• 每孔加入一滴含有 DAPI 的ibidi 封固剂。

• 储存在 4°C 的黑暗中，直到成像。最好立即进行成像，因为较长的存储期可能会降低图像质量。

2.4.成像

• 使用适当的滤光片组在荧光显微镜下观察细胞，必要时使用ibidi 浸油。

• （可选）覆盖图像以创建合并图像

3.结果

HUVEC 在µ-Slide 8 孔高壁中免疫染色 ，宽视场荧光显微镜。F-肌动蛋白细胞骨架被鬼笔环肽（红色）染色。

α-微管蛋白抗体用于染色微管（绿色）。用 DAPI（蓝色）可视化细胞核。该图像是在尼康显微镜上使用具有油浸的 60 倍物镜拍摄的。

广州科适特科学仪器有限公司是德国ibidi公司在中国区合作伙伴

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