目前，患有急性白血病或骨髓增生异常等血液系统恶性肿瘤的患者，在经过同种异体造血干细胞移植（HSCT）治疗后，仍然面临复发的可能，复发是导致治疗失败的主要原因之一。细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK），在体外和体内动物模型中均显示出有效的抗白血病细胞毒性，因此，CIK细胞的应用，可作为一种有前景的免疫治疗方法，用于对抗复发。

考虑到复发患者迫切的治疗需求，德国法兰克福大学的一支研究团队开发出了一种高效的培养工艺，可以利用供体来源的外周血（PB）或白细胞去除术（LP）产品生成不同临床剂量的即用型CIK细胞，解决了与细胞培养相关的血清供应瓶颈的问题，有效地节省了时间、人力和成本消耗，且符合良好生产规范（GMP）。

CIK细胞的生成

常规的CIK细胞培养需要3周的时间。考虑到患者治疗时间的紧迫性，研究人员专注于在更短的时间内生成高效的CIK细胞产品。

通过在培养的第4和第8天添加IL-15，可以使原始材料中具有CIK细胞表型的细胞在10-12天内扩增。与对照组相比，IL-15激活的CIK细胞的体外细胞毒性显著增强，并且在几种已建立的人类白血病异种移植小鼠模型中具有广泛的体内抗白血病功效，使受体存活率提高。采用此种方法，可以建立一个高效的、符合GMP规范的CIK细胞生产工艺，用于提供不同临床剂量规格的细胞产品：1 × 10^6，5 × 10^6，1 × 10^7，1 × 10^8 T细胞/kG受体体重，满足不同患者的需要。

开发替代血清的培养方法
CIK细胞的常规培养需要添加血清，由于临床条件下的生产经常会面临AB血清短缺的瓶颈，研究人员致力于寻找可作为AB血清替代品的培养基补充剂。
通过分别测试添加AB血清、新鲜冷冻血浆（FFP）、血小板裂解物（PL）的培养效果，发现与没有补充剂的对照组相比，AB血清、FFP和PL的存在均可显著提高细胞的扩增速率（10倍），但在这3这种补充剂之间未观察到显著差异。
进一步的检测结果显示，与AB血清相比，用FFP和PL培养的CIK细胞显示出相同的活力、表型（CIK细胞由CD3+CD56阳性的T细胞、T-NK细胞和少数NK细胞组成）以及针对白血病靶细胞系THP-1的细胞毒性。

注：考虑到FFP更容易获得，研究人员已决定采用FFP作为CIK细胞扩增培养的补充剂，并在此基础上对之前的生产许可文件（ATMP § 4b Abs, 3 AMG，许可证号：PEI.A.11630.01.1）进行了相应修改。
CIK细胞的冷冻保存与活力恢复
按照预定的给药剂量，对生成的CIK细胞进行冷冻保存，可以最大限度地减少细胞供应的时间和成本。由于此前的报道缺乏关于冷冻保存和解冻后CIK细胞的活力、细胞毒性等信息。研究人员补充分析了CIK细胞在经过过夜冻存和长期冻存（2年）后的细胞毒性潜力，结果令人鼓舞：

经冷冻保存的CIK细胞仍然具有很高的稳定性和活力：冻存前的存活率为95.9%，过夜冻存后的存活率为92.8%，长期（2年）冻存后的存活率为89.3%。
注：使用可控速率的BIOFREEZE BV45程序降温仪（Consarctic），可将CIK细胞稳定而安全地保存于冷冻袋中，在液氮中储存过夜。

 

注：通过台盼蓝染色，对2016以来的42个解冻样本进行分析（此项分析内容属于产品发布之前QC的一个重要组成部分），在所有情况下，被测样本均满足>70%存活率的要求。基于这些结果，CIK细胞的冷冻保存方法已获得当局（Paul-Ehrlich-Institute）批准。

同时，经冷冻保存后的CIK细胞的恢复能力、表型、细胞毒性，均与新鲜制备的CIK细胞无显著差异。
技技术亮点：

CIK细胞在补充FFP的培养条件下可以保留增殖、活力、表型和功能等主要特征，这些特征在冷冻保存后依然不受影响。研究人员据此成功建立了符合GMP的CIK细胞生产工艺，能够有效减少生产不同治疗剂量的CIK细胞所需的时间、人力及成本投入。

由于整个生产工艺对质控有着非常高的要求，最终的细胞治疗效果取决于很多环节，其中涉及的与样本相关的冻存、溶解以及在液氮中的长期储存，对于后续细胞治疗的效果尤其重要。对于冻存，研究人员选择了Consarctic品牌的BIOFREEZE BV45程序降温仪，使用液氮制冷，低温存储温度可低至-196℃，提供针对不同细胞的冷冻程序，尤其适合于活细胞样品的保存。

参考文献：
Improving Clinical Manufacturing ofIL-15 Activated Cytokine-InducedKiller (CIK) Cells, Front Immunol. 2019 May 31;10:1218. DOI: 10.3389/fimmu.2019.01218. 

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