生物纳米孔传感器背景介绍
生物细胞新陈代谢所涉及的无机离子、葡萄糖、核酸、氨基酸 、蛋白质及其它细胞代谢物的跨膜运输主要是通过生物膜上的特定的膜通道蛋白来介导完成的。这些膜通道蛋白是由蛋白质单体或多聚体于生物膜上自发组装形成的跨膜孔道，是生物细胞在数十亿年的漫长生物进化过程筛选出一系列结构最为精简、运转最为高效的跨膜输运机制。
 
最近备受大家关注的著名结构生物学家颜宁教授的主要研究工作就是细胞膜上的各种物质运输和信号传导的跨膜蛋白的结构与功能。科学家们也已将跨膜蛋白改造成为用途各异的生物传感器，用于检测分析各类生物活性的分子。
 
生物纳米孔(蛋白纳米孔)，是指一种可以嵌入到细胞膜中，形成贯穿膜两侧的纳米尺度孔隙，并作为离子或分子通道的跨膜蛋白。生物纳米孔是由蛋白质亚单位、肽等嵌入到脂质双层或聚合物膜中自组装形成的。例如，第一种被广泛应用的生物纳米孔α⁃溶血素纳米孔(α⁃hemolysin，α⁃HL)(图1)，是由金黄色葡萄球菌分泌的外毒素α⁃溶血素，插入到磷脂双分子层膜中自组装形成的蘑菇状七聚体，该聚合体中间形成了贯穿膜的孔隙，在最窄的点形成宽度为1.4nm的纳米通道。α⁃HL通道的内径和单链DNA(ssDNA)分子的直径非常接近(为1.3nm)，使其可用于分析单链DNA分子。
   
生物纳米孔传感器工作原理
科学家们将纳米孔蛋白嵌入到高电阻率的膜上(生物膜或高分子聚合物膜)，开发出了可用于分析单个分子的传感器。使用生物纳米孔对单个分子进行分析是建立在膜片钳技术基础上的膜通道仿生技术(图2)。其基本原理为在高绝缘性的膜两侧充满离子溶液，纳米孔蛋白在膜上形成贯穿两侧的纳米尺度的孔道，当在膜两侧施加电压时，离子会流过绝缘膜上的纳米孔，从而产生恒定电流。由于生物纳米孔的直径多为1.0~3.0nm，因此在电场力驱动下只能容许一定物理尺寸的单个待测物分子进入并穿过纳米孔，当单分子通过纳米孔的缩颈时会阻挡恒定的离子流(电阻抗效应)，进而造成电流的下降，下降的幅度和延续的时间与通过纳米孔的单分子的粒径、基团的电荷状态和长度等特征紧密相关，因此可利用电场力驱动单个分子通过纳米孔引起的皮安级电流变化来表征单分子的信息。[1]  
不同性状的待测物分子通过不同理化性质的纳米孔蛋白时，产生阻断电流的程度、频率及时间不同，通过对大量阻断电流信号的统计分析，可在单分子水平获取分子的尺寸、结构及电荷等信息(图3)。[2]  
将生物纳米孔作为“天然传感器”并用于分析生物、化学分子的技术始于20世纪90年代中期。1996年，Deamer和Branton教授等首次证实了单个单链DNA(ssDNA)分子和RNA分子可通过由金黄色葡萄球菌 α-溶血素( α-Hemolysin, α-HL)构建的天然纳米孔通道，并且能检测到它们通过这种纳米级孔道时所造成的电流改变。[3]
 
基于这一研究结果，Deamer、Branton和Church教授等进一步提出了根据不同种类碱基通过纳米孔时产生的特征电流阻断信号来推导出单链核酸的碱基序列信息，并最终实现对单分子核酸链的碱基序列测定(图4)。该研究开创了利用生物纳米孔高效分析生物、化学分子的新时代。目前生物纳米孔分析技术已逐步发展成为重要的单分子分析手段，凭借其分析灵敏度高（超高的时间分辨率~10 μs和电流分辨率<0.1 pA）、快速、低成本及无需分子修饰标记(如荧光标记、放射性标记)或表面固定等优势，使得其在生物和化学等诸多领域应用前景广泛。  
生物纳米孔可以通过多种方式形成，孔径范围分布较大(图5)。通过基因工程技术，可得到不同孔径大小、缩颈高度的用于分析不同分子的纳米孔蛋白。生物体中许多进程都会涉及到生物聚合链穿越嵌入生物膜上通道, 这些通道和生物大分子在空间结构尺度上与纳米技术相吻合, 因此生物纳米孔技术的发展为核酸、蛋白质等生物分子识别的研究提供了更多的可能性。利用构建的各种不同孔径和表面特性的纳米孔蛋白，可对离子、DNA、RNA、氨基酸、多肽、蛋白质、药物分子、聚合物大分子等各种物质进行分析表征。  
一般情况下，生物纳米孔的尺寸应与分析物的尺寸相当(图6)，以便被分析物产生出可测量的高信噪比的电流振幅变化。经基因工程定向改造或化学修饰得到的生物纳米孔，可以进一步增强纳米孔与被分析物之间的相互作用，提高其整体灵敏度和选择特异性。[2] 例如，更大尺寸的生物纳米孔，可允许折叠蛋白或结构域等更大的分子进入，以便分析蛋白与其他蛋白、药物或底物的相互作用。科学家甚至开发出了可用于癌症生物标记物检测、药物手性异构体拆分等功能性纳米孔蛋白。  
生物纳米孔分析技术应用与发展
生物纳米孔分析技术最初是为了对离子和小分子进行监测而开发的。最先得以突破性的应用为核酸的测序领域。得益于其显著的优势点：
纳米孔能够以相对较高的速率逐个连续捕获单个分子，这使得纳米孔能够在合理的时间范围内在单分子水平上探索大量分子
纳米孔将分析物的结构和化学性质转换为可测量的电流信号，极大地简化了仪器设备的复杂程度
纳米孔为构建仿生系统提供了一个定义明确的支架，涉及生物分子相互作用的复杂网络，为解开复杂生物过程提供了可行的方法,使得生物纳米孔具有超高的动态分辨率，足以分辨小如单个原子的检测分析物，成为名副其实的单分子分析的多面手，应用前景非常广阔(图7)
 
目前，生物纳米孔分析技术的应用已经不限于：DNA/RNA测序和表观遗传修饰分析(碱基序列及碱基修饰识别)；并以极快的速度拓展到：蛋白质/多肽分析(一级序列、高级构型和构象等)、多糖、聚合物、有机小分子(结构、大小、构型和构象)，金属离子检测及纳米粒子等的表征分析；还可用于分析监测特定生化反应的过程和作为相关生化反应的载体和媒介；甚至是疾病诊断的生物标志物的分析鉴定。[5,6,7,8]   
1、核酸碱基序列的测定
生物纳米孔传感器目前被大规模成功应用的领域为基因测序。已有多款基于生物纳米孔开发的测序仪成功地实现了商业化，并在基础科研领域大放异彩，解决了很多科研难题。当前基于生物纳米孔的核酸测序技术主要有三个流派：纳米孔直接链测序法、引入聚合酶和标记修饰核苷酸的边合成边测序法以及外切酶测序法，这三种技术各有特点。
 
(1)纳米孔直接链测序
其基本原理为核酸分子(DNA/RNA)经接头帮助到达纳米孔附近，在解旋酶/马达蛋白的解旋/控速下，单链通过生物纳米孔的孔道；传感器检测到不同核苷酸通过所引起的电流变化的差异并将其转换为电信号；再根据电信号变化的频谱，应用模型识别算法得到碱基类型从而达到测序的目的(图8)。[9,10]
 
该方法具有测序速度快、碱基修饰可分析、文库构建简单等特点。但由于纳米孔的最窄缩颈部的长度可容纳多个核苷酸，这种结构使得核酸单链分子通过纳米孔时产生的阻断电流信号是由多个核苷酸的整体阻断效应造成的，而非单个核苷酸的阻断效应造成的，并且较难从整体阻断电流信息中清晰地得出单个碱基的阻断电流信息，特别是检测单一碱基连续多次重复的均聚物时，容易漏读和多读。  
(2)引入聚合酶和标记修饰核苷酸的边合成边测序法
著名的遗传学家George Church教授和基因测序技术专家Jing yue Ju教授等基于生物纳米孔传感器开发出了一种新的DNA测序平台，该平台包含磷脂膜上由7个亚基形成了纳米孔孔道，其中一个特定的亚基上通过肽链桥/小分子链结合了仅具有合成功能的DNA聚合酶，可以合成与待测模版链互补的DNA链。通过预先连接在模版链上的引物，聚合酶掺入互补的核苷酸(dNTP)，每一种核苷酸都携带了特定的标记物(Tag)。当聚合酶按照模板逐步合成时，标记物依次被切割，在电场力和半封闭的空间通道引导的综合作用下进入到纳米孔中引起特征电流的阻断信号，从而达到表征核酸序列的目的(图9)。[11,12]
 
该方法具有测序准确度高等特点。但由于引入了特种DNA聚合酶及碱基标记物修饰的核苷酸，整个系统的复杂程度高，需要各个工作元器件精妙的配合才能够实现有效测序。  
(3)外切酶测序法
其基本原理为核酸单链在核酸外切酶的作用下，被依次剪切为单核苷酸，在电场力的作用下，待检测单个核苷酸通过纳米孔时引起的电流变化，根据不同种类碱基通过纳米孔时产生的特征弱离子流信号，即可读出每条单链DNA上的序列信息。由于单个核苷酸通过纳米孔的速度极快，且造成的阻断电流信号极小，单个核苷酸之间引起的电流阻断的差异极其微弱，目前还无法有效地用于区分核苷酸的种类，阻碍了外切酶-纳米孔测序技术的发展和应用。
 
2、核酸碱基修饰的测定
DNA的碱基修饰（包括5-mC、5-hmC、5-fC、5-caC、4-mC和6-mA等）在个体发育、衰老和癌症的筛查和诊断中发挥了重要功能。这些修饰并不干扰Watson-Crick配对原则，但能调控基因的开关。与DNA类似，RNA也具有多种修饰(真核生物常见为6-mA)，并且这些修饰参与了mRNA的剪接和蛋白翻译等各个方面。了解特定修饰在基因组或转录组上的精确定位是解析其生物学功能的关键。近年来利用高通量测序鉴定DNA/RNA修饰位点的技术极大地助力了表观基因组学和表观转录组学的研究。DNA甲基化检测的方法有很多种，但大多离不开亚硫酸氢盐转化。亚硫酸氢盐转化是将序列中未甲基化的胞嘧啶（C）转变为尿嘧啶（U），而甲基化的胞嘧啶保持不变。然而，重亚硫酸盐处理会导致DNA的降解，限制了在稀少珍贵样品中的应用。另外，由于占基因组95%的未甲基化C转变成了T，降低了测序片段的匹配基因组的效率，也带来了覆盖度的偏好性。且该方法并不能区分5-mC和5-hmC，也无法识别其他类型的碱基修饰。反转录和PCR扩增会导致RNA碱基的修饰信息丢失，因此无法通过二代测序平台来直接分析鉴别RNA上的碱基修饰情况。必须依靠抗体免疫沉淀或化学修饰可以实现全转录组RNA修饰图谱绘制。但这些方法可检测的修饰种类有限，且通常只针对一种特定的修饰，仍有大量 RNA 修饰无法被检测或被定位。目前大量的研究显示，基于生物纳米孔分析计划，可以高效地识别DNA和RNA上的多种类型的碱基修饰。
 
(1)DNA碱基修饰的识别
生物纳米孔测序技术能够检测核酸分子自身的物理化学特性，与未被修饰的核苷酸相比，被修饰的相同核苷酸通过纳米孔时对电流产生的电流阻断信号会发生特异性的改变，因此基因组上的修饰信息能被电流阻断信号表达。研究表明，带有甲基化修饰的核苷酸和不带修饰的相同核苷酸通过纳米孔时会产生不同的电信号特征，因此通过深度学习模型捕获甲基化修饰分子的特殊电信号模式可以发展出基于生物纳米孔测序信号的DNA分子甲基化修饰检测工具(图10A)。可以进行长片段的读取，并且具有直接获取DNA修饰(无需化学或抗体处理)，具有重要意义。[13,14]  
(2)RNA碱基修饰的识别
通过基于生物纳米孔的技术，在不经反转录、无需扩增的条件下即可直接读取 RNA 上的所有碱基修饰信息，极大的提高了RNA碱基修饰识别的效率(图10B)。Huanle等借助纳米孔测序平台对RNA进行直接测序，高精度地检测出N6-甲基腺苷(m6A) RNA修饰，准确率达90%。该结果通过直接RNA测序鉴定RNA修饰的概念验证，并为将来探索其他RNA修饰提供借鉴，为研究RNA修饰在其天然RNA环境中的生物学作用开辟了新途径。[15]
 
南京大学黄硕教授团构建了一种高分辨的耻垢分枝杆菌膜蛋白A(MspA)纳米孔，可以准确识别所有的经典核苷酸和它们的主要修饰，实现了高达7种常见修饰核苷酸的同时检测，包括5-甲基胞苷(m5C)、N6 -甲基腺苷(m6A)、N7-甲基鸟苷(m7G)、N1-甲基腺苷(m1A)、肌苷(I)、假尿嘧啶(Ψ)和二氢尿嘧啶(D)。为直接检测 RNA 上的修饰，该团队利用核酸外切酶将天然 RNA 消化成单核苷酸，然后使用高分辨纳米孔检测和机器学习分析，获得消化产物中核苷酸的组成和丰度，最终重构出原始 RNA 的序列组成和修饰信息，为直接鉴定 RNA 中的表观遗传学修饰提供了快速方便的单分子分析方法(图11)。[16]  
生物纳米孔传感器小结与展望
生物纳米孔分析技术作为一种新颖的单分子分析手段，已广泛应用于单分子水平上DNA、RNA、多肽、蛋白质、代谢产物的分析和表征，且不断拓宽新的应用边界。越来越多的科研及临床工作者致力于将单分子纳米孔分析技术应用到基础科学研究和疾病的临床诊断中，并取得了很多优异的成果。随着生物纳米孔检测技术和平台的不断提升和完善，并与其它传感技术交叉融合，必将极大地推动基础科研和精准医疗的快速发展。
 
但也能发现，生物纳米孔技术在实际样品检测、数据处理和检测装置等方面还存在着一些不够完美之处，这些问题都一定程度限制了生物纳米孔分析技术从科学研究到实际应用的快速转化和推广。例如：
生物纳米孔自身的灵敏度和选择性仍有待进一步提高，需通过基因工程技术不断定相优化纳米孔自身的特性。
生物纳米孔分析技术产生的数据量庞大、信号形态复杂、处理过程繁琐、耗时等，需要不断提升信号分析的算法和算力的综合性能，才能准确解读这些数据信息。
高时间分辨、高电流分辨的生物纳米孔匹配的信号采集和处理器发展较慢，纳米孔生物传感分析技术所能达到的时间分辨率、电流分辨不但与生物纳米孔自身的特性有关，也与其匹配的信号采集和处理器的性能直接相关，需要进一步提升这些传感器的性能，才能整体提升生物纳米孔传感器的综合性能。
 
现阶段，单分子基因测序是生物纳米孔传感领域内最重要的应用，随着纳米孔测序技术产业化逐步展开和升级，人们对超高通量纳米孔测序（100万个孔道及以上）的需求愈发迫切，因此亟待发展一种新型的纳米孔检测模式，在降低检测成本的同时能够突破现有检测通量的局限。
 
参考文献
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[2]. Biological nanopores for single-molecule sensing. iScience. 2022 Mar 23;25(4):104145.
[3]. Characterization of individual polynucleotide molecules using a membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996 Nov 26;93(24):13770-3.
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[5]. Progress in Biological Nanopore-based Analysis Technology[J]. Chinese Journal of Applied Chemistry,2017. 34(8): 855-867.
[6]. Nanopore-Based Confined Spaces for Single-Molecular Analysis. Chem Asian J. 2019 Feb 1;14(3):389-397.
[7]. Nanopore-based technologies beyond DNA sequencing. Nat Nanotechnol. 2022 Nov;17(11):1136-1146.
[8]. Application of Nanopore Sensors for Biomolecular Interactions and Drug Discovery. Chem Asian J. 2022 Oct 4;17(19): e202200679.
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[10]. Automated forward and reverse ratcheting of DNA in a nanopore at 5-Å precision. Nat Biotechnol. 2012 Feb 14;30(4):344-8.
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[12]. Real-time single-molecule electronic DNA sequencing by synthesis using polymer-tagged nucleotides on a nanopore array. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016 May 10;113(19):5233-8.
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[15]. Accurate detection of m6A RNA modifications in native RNA sequences. Nat Commun. 2019 Sep 9;10(1):4079.
[16]. Identification of nucleoside monophosphates and their epigenetic modifications using an engineered nanopore. Nat Nanotechnol. 2022 Sep;17(9):976-983.